疱疹病毒治疗性疫苗研究进展

刘 占,马宁宁,郭子仪,邓梦梦,史志斌,陈 陆

疱疹病毒科病毒为双股线性DNA病毒，是引起人与动物疾病的一类重要病原。根据病毒的生物学特性和基因组特点，疱疹病毒科可分为α、β和γ 3个亚科。疱疹病毒典型的感染特征是能够建立潜伏感染，感染者或康复者长期携带病毒，在潜伏感染期间，病毒保持休眠状态，借以逃避宿主免疫系统的监视。而机体在受到应激后，潜伏的病毒被重新激活，并引起相应的疾病，这一特点使得疱疹病毒感染难以被根治。

治疗性疫苗能改善及增强机体对疫苗靶抗原的摄入、表达、处理、递呈，激活免疫应答，唤起机体对靶抗原的免疫应答能力，达到清除病原体或异常细胞从而治愈疾病的作用。治疗性疫苗已在艾滋病[1]、慢性乙型肝炎[2]、肿瘤[3]等多种疾病领域取得较大的进展。目前疱疹病毒感染引发的各类疾病仍以预防性疫苗接种和抗病毒药物治疗为主，无法防止其复发性感染。因此，研发可抑制疱疹病毒复发性感染或清除潜伏感染的治疗性疫苗具有重要意义。

1 疱疹病毒潜伏感染与再激活

疱疹病毒最初感染宿主时，病毒粒子通过破损的皮肤、黏膜等侵入机体，随即在细胞内复制和增殖，在复制期间，疱疹病毒基因组以级联方式进行相关蛋白的表达。之后嗜神经性子代疱疹病毒侵入神经系统，跨突触在神经元间传播，最后沿着神经轴索逆行运输到神经元胞体并建立潜伏感染。潜伏感染期间，疱疹病毒以严格的机制维持潜伏感染状态，病毒DNA在细胞内以附加体的形式存在，裂解性基因处于转录抑制状态，病毒基因组仅限于潜伏相关转录本(Latency-associated transcripts，LAT)的转录，被感染的细胞不产生感染性病毒粒子，因而宿主不表现出任何临床症状[4]。具有神经嗜性的疱疹病毒通过潜伏在宿主不进行分裂的感觉神经元细胞中，从而逃避机体免疫系统的监视，仅有极少部分基因仍保持较低水平的表达，以保证病毒能被有效激活。具有淋巴嗜性的疱疹病毒在潜伏感染期间则保证基因组特定基因在其贮存的淋巴细胞特定区域内的转录和复制，通过此严格调控机制介导病毒逃避宿主免疫系统的监控，且能够保证被感染细胞不会发生细胞凋亡而导致细胞死亡[5]。潜伏感染期间，当机体免疫水平降低、宿主处于应激状态时，休眠状态的病毒被重新激活，病毒裂解性基因大量表达，从而增殖感染性病毒粒子并引发相关疾病。疱疹病毒潜伏感染再激活由一系列机制维持，包括特异的神经因子、病毒因子(如LAT和病毒微小RNA)及对病毒基因组的表观遗传学调控[6]。因此，很有必要构建一些不表达特定因子的突变体病毒，并研究其对潜伏感染再激活的影响。

2 疱疹病毒治疗性疫苗的目标

多数疱疹病毒可以在机体内建立长期潜伏感染，目前尚无机体免疫可以清除潜伏感染的证据。抗病毒药物疗法虽然在控制复发性疱疹病毒感染上有一定成效，但该法用药周期长且病毒可能发生变异而产生耐药性[7]，并不能有效防止病毒复发性感染。疱疹病毒预防性疫苗并不能预防潜伏性感染的建立，且未能有效阻止机体发生复发性感染[8-10]。治疗性疫苗的最终目的是能够激活有效的免疫应答反应，并能产生长期的记忆性细胞反应，可以防止病毒复发性感染，因此，治疗性疫苗更具有优势和应用前景[11]。治疗性疫苗是通过诱导或增强特定的免疫功能，增强控制潜伏感染的特异性免疫反应的能力，从而减轻复发性疾病的症状和体征以及降低复发率。疱疹病毒复发性感染时不断刺激相对应的效应淋巴细胞，最终造成这些细胞的耗竭，逐步丧失效应功能、增殖潜力以及分化为免疫记忆细胞的能力。因此研发的治疗性疫苗可以刺激这些病毒特异性CD8+T细胞，使之重新增殖形成更多的具有效应功能的特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞群(Cytotoxic T cell，CTL)，进而杀灭病毒感染的细胞。潜伏感染的建立常伴随着抑制性免疫微环境的形成，因此，疱疹病毒治疗性疫苗的研发须着重于调控或逆转病毒感染造成的抑制性免疫微环境以及提高疫苗诱导形成的效应CD8+T细胞在抑制性免疫微环境下的免疫应答效力。随着对抗病毒免疫应答认识的不断深入，人们发现CD4+T淋巴细胞不仅有助于CTL的活化，而且其本身也发挥着多种效应细胞的功能。因此，理想的治疗性疫苗应该考虑多种抗原的多价多表位与疫苗组合，在提高疫苗免疫原性方面最大限度发挥CTL抗病毒作用，同时充分发挥其它抗病毒成分的功能。

3 基于T细胞的疱疹病毒治疗性疫苗研究进展

多数疱疹病毒发展出多种机制来逃避宿主的免疫应答，并在机体内建立潜伏感染。适应性免疫反应产生的T细胞可以清除病毒感染的细胞且具有特异性及长期免疫记忆能力，鉴于T细胞免疫应答对控制疱疹病毒再激活的重要性，目前研发的疱疹病毒治疗性疫苗多数基于诱导T细胞免疫应答的原理而设计。

3.1基于系统性效应T细胞反应的治疗性疫苗 T细胞介导的保护性免疫在抗疱疹病毒感染中发挥至关重要的作用，疱疹病毒感染机体后诱导T细胞介导的全身性免疫应答，T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为效应T细胞，协同细胞因子对抗原进行直接杀伤，因此治疗性疫苗的效果与机体诱导系统性T细胞免疫应答反应的强弱和持续时间密切相关。基于此，Bernstein等[12]考虑到治疗性单纯疱疹病毒 (Herpes simplex virus, HSV)亚单位疫苗的抗原和佐剂选择在诱导T细胞免疫应答方面的重要性，研发了一种HSV-2治疗性疫苗—GEN-003。该疫苗将HSV感染者抗体和CD4+T细胞识别的主要靶抗原gD2与运用高通量蛋白质组学方法鉴定的CD8+T细胞抗原感染细胞蛋白4(infected cell protein 4, ICP4)相结合，并应用了增强免疫反应的佐剂Matrix-M2。由于IFN-γ是反映疫苗诱导有效免疫应答的细胞因子[13]，研究通过IFN-γELISPOT方法检测疫苗免疫小鼠后T细胞反应的强弱程度，结果证明该疫苗诱导更加强烈持久的系统性T淋巴细胞免疫应答，接种后可减少约50%的疾病复发率。

爱泼斯坦-巴尔氏病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)的发生发展密切相关，大多数治疗性EBV疫苗的研究都与NPC相关[14]，且EBV的 核抗原1 (Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1,EBNA1)和潜伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2,LMP2)抗原是免疫治疗的靶点。基于T细胞免疫应答在控制疱疹病毒感染过程中的重要性，朱伟等[15]使用含有EBV LMP2与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合基因CSF2A重组质粒转染树突状细胞，载有抗原肽的树突状细胞迁移至二级淋巴器官，在此激活特异性T细胞免疫应答，诱导活化机体更多的EBV LMP2特异性CTL，具有更强的杀伤EBV肿瘤细胞作用。Taylor等[16]研发了以安卡拉牛痘病毒为载体同时表达部分EBNA1和全长LMP2两种蛋白的疫苗，并通过IFN-γELISPOT方法检测抗原特异性T细胞数量变化。结果证实与免疫前相比外周血中特异性CTL 数量提高了数倍，诱导了更高水平的特异性T细胞免疫应答。另外，靶向 EBNA1和LMP2抗原的治疗性疫苗在专注于诱导强烈而持续的CTL反应的同时也应注重疫苗诱导的抗原特异性CTL的活性。Ge等[17]利用激光扫描共聚焦显微镜和实时无标记细胞分析技术动态监测CTLs介导的靶细胞特异性杀伤能力及杀伤效率，发现重组腺病毒rAd-LMP2疫苗诱导的LMP2特异性CTLs对表达EBV-LMP2的肿瘤细胞具有选择性的细胞毒性，展现较好的肿瘤细胞杀伤效率。该研究将有助于了解以EBV-LMP2为靶点的治疗性疫苗并改进其免疫治疗策略以达到更好的临床效果。

3.2基于局部性记忆T细胞反应的治疗性疫苗 疱疹病毒感染后，机体产生CTL和辅助性CD4+T细胞来控制病原体的扩散，并产生记忆细胞。当机体发生复发性感染时，存在感染部位的组织常驻记忆T细胞(Tissue-resident memory T cells，TRM)发生增殖，同时中央记忆T细胞(central memory T cells，TCM)分化出大量外周组织循环效应记忆T细胞(Effector memory T cells，TEM)迁移到感染部位，从而迅速产生强烈的局部性免疫记忆反应，抑制病毒的再激活[18]。因此，治疗性疫苗设计的重要策略之一是增加机体TEM和TRM细胞的数量，进而诱导局部强烈持久的T细胞免疫记忆反应。Khan等[19]对HSV-1进行了全基因组分析，筛选出3个激活多功能效应记忆T细胞的HLA-A*0201限制性CD8+T细胞表位肽，并使用3个无症状潜伏感染个体的CD8+T细胞表位刺激CD8+T细胞的产生，然后再局部注射趋化因子CXCL10以在三叉神经节部位招募足够数量的HSV-1特异性T细胞，通过检测重新激活HSV-1后小鼠眼部的病毒滴度及临床症状的变化，证明了该策略增加潜伏感染HSV-1的HLA-A*0201转基因小鼠TG部位特异性CD8+TEM和TRM数量并且增强它们的功能，从而有效抑制HSV-1的再激活，减少疱疹性眼病的复发。

机体清除入侵的疱疹病毒后，在淋巴和外周组织均建立了记忆性T淋巴细胞群，然而当机体发生复发性感染时，TEM细胞向皮肤、阴道等外周组织的迁移受到粘附分子和趋化因子受体表达的高度限制[20]。当HSV-2感染患者机体发生复发性感染时TRM细胞最先迅速作出反应，通过分泌IFN-γ控制住病毒的扩散并进一步清除病毒，发挥重要的免疫保护作用[21]。因此，与TEM细胞相比，TRM细胞在机体发生复发性HSV-2感染期间可以更好的增强复发性感染局部免疫力。Bernstein等[22]设计了含有HSV-2糖蛋白gB、gC和gE并加入免疫佐剂CpG的三价亚单位疫苗，该疫苗选择的3种抗原可以有效地诱导机体产生体液和细胞免疫应答。利用豚鼠模型接种该疫苗诱导强烈的系统性T细胞反应，然后通过局部使用咪喹莫特增加豚鼠背根神经节和阴道黏膜内CD8+TRM细胞数量，从而诱导复发性感染部位更加强烈的局部特异性T细胞免疫反应，进一步增强了HSV-2治疗性疫苗的治疗效果，显著降低了生殖器疱疹的复发率。Srivastava等[23]筛选出无症状潜伏感染者中被效应CD4+和CD8+T细胞高度识别并具有良好免疫原性的8种HSV-2蛋白，其中由UL40基因编码的核糖核苷酸还原酶2(RR2)是最具免疫原性的病毒蛋白，选取该蛋白在复发性生殖器疱疹豚鼠模型中探索其免疫原性和保护性效果，结果证实接种含有RR2蛋白的亚单位疫苗后机体产生较高的中和抗体效价，且RR2诱导的抗体与免疫治疗糖蛋白(例如gB和gD)发生了交叉反应，该疫苗诱导产生阴道黏膜内功能更强、数量更多的CD4+和CD8+TRM细胞，显著减少了复发性生殖器疱疹病变和复发频率。上述研究证明2种特异性记忆细胞在防止疱疹病毒感染性疾病的复发中发挥了关键作用，如果可以通过某种治疗性疫苗将足够数量的特异性TEM和TRM细胞招募到机体复发性感染的部位中，则可能永久遏制病毒的再激活。

3.3基于过继性T细胞疗法的治疗性疫苗 EBV感染机体后激活B淋巴细胞使其扩增并在此细胞内建立潜伏感染，T细胞免疫反应在EBV免疫治疗中具有重要作用，T细胞与EBV的EBNA1、LMP1和LMP2抗原具有较高的亲和力，可诱导强烈的特异性CD8+T细胞免疫应答，进而控制病毒感染[24]。因此，可以输注自体特异性CTL从而提高T细胞杀伤靶细胞的能力，达到更好的免疫治疗效果。Smith等[25]利用表达EBNA1、LMP1和LMP2 3种抗原表位的新型腺病毒载体—AdE1-LMPpoly体外刺激扩增EBV特异性CTL进行过继性T细胞免疫治疗，此方法与使用基于淋巴母细胞系刺激扩增EBV特异性T细胞相比[26]，AdE1-LMPpoly载体可快速扩增功能更强的T细胞，然后通过研究扩增T细胞表型与功能特征及治疗后临床症状，证明该免疫治疗策略诱导了强烈的特异性T细胞免疫应答，具有良好的耐受性、安全性和有效性。免疫功能障碍人群感染EBV后，由于CD8+T细胞功能缺陷，被感染的自身反应性B细胞和浆细胞在中枢神经系统中滞留，从而导致多发性硬化症的发生。Pender等[27]证明了多发性硬化症患者脑中EBV感染的B细胞仍然表达上述3种抗原，利用AdE1-LMPpoly载体体外刺激扩增EBV特异性CTL，然后输注患者体内，通过检测患者临床症状、脑部损伤情况以及脑脊液IgG含量变化，证明过继转移的CD8+T细胞杀死了中枢神经系统中EBV感染的B细胞，从而防止中枢神经系统进一步的自身免疫攻击。EBV特异性T细胞过继免疫治疗是一种靶向性和无毒性的免疫治疗策略，但该方法受到主要潜伏相关基因和蛋白表达谱、HLA限制性以及已知EBV表位的低免疫显性的限制[28]，因此扩大EBV特异性T细胞表位库克服其局限性是发展和改进特异性免疫治疗策略的主要挑战。此外，人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)、人类疱疹病毒6型 (Herpesvirus 6, HHV-6)控制病毒感染也主要依赖T细胞免疫，且根据2种病毒感染治疗研究进展发现其在研治疗性疫苗是基于过继性T细胞疗法而设计，研究证明利用转移抗原特异性T细胞来建立免疫功能，也可以有效治疗HCMV、HHV-6感染，过继性T细胞治疗已成为异基因造血干细胞移植患者HCMV、HHV-6再激活的一种治疗方法[29-30]。

4 结论与展望

多数疱疹病毒感染机体后难以被监测和控制，宿主经常会发生复发性感染，治疗其复发性感染成为了防控疱疹病毒的关键。治疗性疫苗能够激活有效的细胞免疫反应，彻底清除病毒，并能产生长期的记忆性细胞反应，防止疱疹病毒的复发性感染并替代药物治疗。研究疱疹病毒治疗性疫苗的模式病毒主要为HSV-1、HSV-2、EBV且多数疱疹病毒治疗性疫苗都停留在实验研究阶段，还存在较多问题尚待进一步研究。各亚科疱疹病毒之间具有极其相似的潜伏感染机制，随着对疱疹病毒结构及功能的深入研究，人们越来越清晰地认识到，疱疹病毒潜伏和激活并非病毒基因独立促成的，而是病毒、细胞和免疫系统之间相互作用的结果。因此，根据现有疱疹病毒治疗性疫苗设计原理，结合疱疹病毒潜伏感染机理及免疫机制的深入研究，可以为其余疱疹病毒治疗性疫苗的研发提供方向。疱疹病毒治疗性疫苗具有广阔的应用前景，未来期望可以通过治疗性疫苗接种与其他形式的免疫治疗方法相结合将免疫治疗方法纳入疱疹病毒标准治疗方案。

利益冲突：无