疟原虫在人体内发育过程的研究进展

姚鹏飞，张鹏江，孙 杨

疟疾是由疟原虫引起的虫媒传染病，在全球尤其是热带地区肆虐流行，每年约2.28亿人发病，40.5万人死亡[1]，严重威胁着人类的健康。目前，临床常用奎宁和青蒿素类药物对疟疾患者进行预防和救治[2]，但是在疟疾肆虐的国家，上述药物不易获得且价格昂贵，会给患者造成较重的医疗和经济负担。此外，随着药物耐药性增加，疟疾的治疗与防控效果也逐年下降，因此具有适应性和持久性的抗疟疾疫苗成为研究热点。目前，疫苗相关研究主要围绕疟原虫生命周期不同阶段或多个阶段的生物分子抗原开展。因此，本文重点就疟原虫在人体内发育过程的研究进展进行综述，为疟疾疫苗研发和疟疾防控救治提供参考。

1 无症状红细胞外期

1.1 子孢子接种 疟原虫感染的雌性按蚊叮咬人体后，通过唾液管注射唾液至皮下，产生局部麻醉效应并形成局部小血肿，位于唾液腺中的感染性子孢子与唾液一起注入皮肤真皮层。由于人体皮肤的分层结构，按蚊的喙部常刺入真皮层，但皮肤的厚度因部位不同，少部分子孢子也可能被注入表皮层或皮下组织。只有20%接种的子孢子能够成功离开真皮层[3]。

1.2 子孢子迁移 感染的雌性按蚊唾液中含有γ干扰素诱导的巯基还原酶，其不利于子孢子迁移运动[4]。子孢子接种于皮肤后，必须离开皮肤迁移到血管才能成功转运至肝脏继续其生命周期，因此须要突破多个细胞屏障，包括皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、皮肤吞噬细胞以及肝窦状隙的Kupffer细胞和肝细胞。子孢子能靶向肝细胞迁移，是因为肝窦组织及肝细胞表面含有高度硫酸化的硫酸肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans,HSPGs）[5]。子孢子离开皮肤依赖子孢子滑行运动和细胞穿越能力的两种行为[6-7]。

滑行运动是一种基质依赖性运动，其特点是缺乏纤毛或鞭毛，并且没有明显细胞形态的改变[8]。滑行运动的关键分子是子孢子细胞表面跨膜蛋白——血小板反应蛋白相关匿名蛋白（thrombospondin-related anonymous protein,TRAP）家族，上述蛋白在区域构造上具有几个共同特征，包括细胞外黏附结构域和胞浆结构域，其连接到肌动蛋白-肌球蛋白分子马达[5]，子孢子必须黏附到基质或细胞上以提供拉力[8]。子孢子细胞外黏附域与基质结合，使分子马达向后转移TRAP，从而将子孢子向前推进。TRAP家族中最关键的蛋白是TRAP，因为靶向TRAP导致的突变，子孢子的运动方式或速度只发生轻微变化，但血管侵袭性和感染性显著降低[6]。同样，辐射减毒能够消弱子孢子，调整其运动角度，影响移动速度，改变运动类型和方向[9]。滑行运动几乎是任意方向，直到它们接触血管内皮细胞或者淋巴系统。子孢子迁移特征的研究有助于终止迁移运动抗体的研发[10]。

子孢子离开皮肤的另外一个关键特性是子孢子穿越宿主细胞的能力，这种能力对于子孢子从接种点迁移至肝细胞非常重要。细胞穿越包括活跃的子孢子进入宿主细胞，快速迁移通过细胞质，然后从宿主细胞膜排出等过程[11]。子孢子能够穿越细胞依赖子孢子穿越微丝蛋白和穿孔素样蛋白-1（perforin-like protein-1,PLP-1）。子孢子在不破坏宿主细胞膜的基础上，通过封包于暂时性空泡（transient vacuoles,TV）内穿越细胞，随后子孢子利用pH敏感性和PLP-1自TV排出，避免了宿主溶酶体降解，达到逃避宿主细胞防御的目的[11]。研究发现，基因敲除编码子孢子穿越微丝蛋白的基因对子孢子穿越宿主细胞的能力具有重要影响[12]。

两种活动类型表明，远离血管真皮层的子孢子移动快且移动距离相对较大，邻近血管处的子孢子活力受到限制，移动慢且路径更加弯曲，但有利于与血管接触[6]。上述过程中，仅部分子孢子到达目的地，大部分在真皮层被宿主自身免疫系统破坏清除；或者进入淋巴管，引流到达淋巴结，最终被吞噬清除。进入血管的子孢子快速被血流带走，进入淋巴系统的则较缓慢。大约15%～20%的子孢子最终引流进入淋巴结，成为最初存活的子孢子，但其不能继续发育至红细胞期，将成为免疫反应的抗原。子孢子的靶向抗体显著影响其在小鼠皮肤中的运动，证实子孢子是有效的疫苗靶点[3]。

1.3 子孢子入侵肝细胞 子孢子通过血流靶向HSPGs运输到达肝脏，通过感知肝窦状隙血流环境，黏附到窦状隙内皮细胞。子孢子在TV内穿越有孔内皮细胞和巨噬细胞样Kupffer细胞构成的窦状隙屏障[13]，最后驻留在一个肝细胞中。穿越窦状隙屏障对子孢子感染肝细胞很重要，因为它启动了子孢子入侵肝细胞的过程。缺乏细胞穿越能力的子孢子不能达到血管，逐渐被吞噬清除[13]。细胞穿越需要的蛋白包括子孢子穿越微丝蛋白、PLP-1、动合子和子孢子细胞穿越蛋白、磷脂酶、配子逸出和子孢子穿越蛋白等[14]。

子孢子一旦跨过内膜转运至肝脏，就由“迁移模式”转变为“入侵模式”。子孢子表面6-半胱氨酸结构域蛋白P36是识别和有效入侵肝细胞的关键决定因素之一。恶性疟和间日疟分别与宿主细胞CD81受体和清道夫受体BI结合进而感染肝细胞[15]。钙依赖蛋白激酶6激活转换信号，通过结合肝细胞呈递的HSPGs，降低了子孢子细胞穿越能力，促进了环子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP）的分解，使子孢子转换为肝细胞入侵模式[16]。CSP由一个高重复区和一个黏附性I型凝血酶敏感蛋白重复序列（thrombospondin repeat,TSR）组成。迁移过程中，CSP羧基端掩盖了细胞黏附域，该域在唾液腺子孢子中也被掩盖。接触肝细胞时，CSP与HSPGs结合，激活CSP水解程序，CSP被疟原虫蛋白酶水解，移除羧基末端，暴露细胞器顶端TSR黏附域，进而附着在内皮上，将迁移性子孢子转化为侵入性子孢子[17]。到达肝细胞后不久，细胞的穿越活动就停止了，进入了生命周期的下一阶段。

子孢子顶端微线体释放蛋白P36和P52能与肝细胞肝配蛋白A2受体相互作用，形成纳虫空泡（parasitophorous vacuole,PV）[18]。无论哪种跨膜转运方式，子孢子最终都在肝细胞中的纳虫空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）内。由于疟原虫驻留在PV中，从宿主细胞到疟原虫的营养运输和从疟原虫到宿主细胞的信号传递变得复杂。疟原虫驻留在细胞内PVM中，持续发育，直至肝细胞期结束。

1.4 肝细胞内分裂增殖 子孢子进入肝细胞后，速发型子孢子第2 d开始DNA复制并进入分裂模式。经过反复分裂，子孢子逐渐发育成为侵入性结构，称为裂殖子，发育顶峰时每一个感染的肝细胞能够释放40 000个裂殖子。迟发型子孢子须经过休眠期后才开始裂体增殖，这个阶段的子孢子叫做休眠子，恶性疟原虫和三日疟原虫无休眠子。

PVM完全解体后，大量裂殖子释放到宿主细胞细胞质，同时被宿主细胞膜包装成充满裂殖子的小囊泡（称为微体），使疟原虫避开宿主免疫系统，尤其是在进入血液的过程中，避开了众多的Kupffer细胞[19]。研究表明，肝细胞内疟原虫排出需要半胱氨酸蛋白酶，因此靶向破坏半胱氨酸蛋白酶活性可以阻止疟原虫从肝细胞排出[20]。成熟的裂殖子称为红细胞外裂殖子，其进入血液后部分被吞噬细胞吞噬杀灭，部分侵入红细胞定居于PVM内发育增殖[21]。

2 有症状红细胞内期

2.1 裂殖子入侵红细胞 裂殖子释放到血液循环中后，游离裂殖子以快速、动态、多步骤的过程侵入红细胞[22]，由此进入疟原虫红细胞内期。疟原虫裂殖子结构包括稠密颗粒、微丝、棒状体以及这些细胞器分泌的多种蛋白，比如活性酶二肽氨基肽酶[23]、红细胞结合样蛋白家族[24]、RhopH复合体[25]，上述结构或蛋白有利于裂殖子侵入并附着红细胞。裂殖子通过表面蛋白1将裂殖子附着于红细胞，顶膜抗原-1（apical membrane antigen-1,AMA-1）通过再定向作用，使裂殖子尖端与红细胞膜并列，棒状体颈部蛋白2与AMA-1相互作用，使裂殖子和红细胞膜间形成紧密连接，最后裂殖子跨膜蛋白TRAP在肌动蛋白-肌球蛋白分子马达产生的拉力下完全侵入红细胞[26-27]。红细胞期的疫苗能够减慢裂殖子黏附侵入红细胞，从而达到预防目的[28]。

2.2 裂殖子红细胞内繁殖 裂殖子从受感染的红细胞中排出和侵入新的红细胞，是疟原虫指数级无性繁殖的必要过程。在感染的红细胞内，疟原虫经历了裂殖的无性繁殖过程。侵入红细胞不久，疟原虫变成拥有红色核点和蓝色环状胞浆的环状体，称为早期滋养体。随着发育长大，胞浆伸出不规则的伪足以摄噬血红蛋白，最终形成晚期滋养体。未被利用的血红蛋白分解成正铁血红素颗粒沉积在原浆内呈棕褐色，称为疟色素。当宿主红细胞营养耗竭时，裂殖子细胞器分泌不同的蛋白酶，促使PVM和红细胞膜破裂[29]，疟原虫爆发性释放并侵入新的红细胞。一旦红细胞期产生的疟原虫数量超过某个阈值（大约100/µl），疟疾的症状就会出现。

2.3 疟疾临床发作过程 裂殖子通过体内TNF-α和血糖水平的日常节律变化进行周期性生长发育。疟原虫几乎于同时间点，以类似的速率发育并释放裂殖子、解体的液泡和其他代谢产物[30]，疟原虫抗原成分的集中出现，诱导产生了大量促炎细胞因子和趋化因子，引起强烈的先天性免疫反应，导致疟疾寒战、高热、头痛等典型症状发作[31]。恶性疟原虫可以在感染红细胞表面表达恶性疟红细胞膜蛋白-1分子，后者介导感染的红细胞与宿主血管内皮细胞受体结合，使感染的红细胞沉积在重要脏器的微血管床上，导致肺、肝、肠、脑和胎盘血液循环障碍[32-34]。

在疟原虫的血液期，部分裂殖子在红细胞内经3～6 代裂体增殖后，不再进行无性分裂，逐渐发育为雌性配子体或雄性配子体。配子体在人体内可存活2～3个月，当人体再次被雌性按蚊叮咬后，病原体又传播给按蚊，配子体继续在按蚊体内发育。因此，阻断配子体传播给蚊虫可以有效控制疟疾的传播和感染[35]。

3 小 结

综上所述，疟原虫在人体内发育过程极其复杂，经历了疟原虫（即子孢子、裂殖子）人体红细胞外、红细胞内入侵及发育等过程，疟原虫在各阶段拥有不同的生物学特征，据此可以研究和开发阻断疟原虫发育繁殖的药物和疫苗，以达到高效控制疟疾传播目的。