IL28B基因多态性对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效及停药后复发的影响

李 莎，莫雨灵，吕建楠

我国现有慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者约为2000万，其中30%～50%为HBeAg阴性，而HBeAg阴性患者更易进展为肝硬化和肝细胞癌[1]。核苷（酸）类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]、聚乙二醇干扰素-α（pegylated interferon-α,Peg-IFN-α）及普通 IFN-α 单药、联合或序贯治疗是当前国内指南推荐的首选抗HBV方案，然而疗效存在较大的个体差异，因此，推测宿主遗传背景下的免疫反应可能影响HBV感染后的疾病转归及抗病毒疗效[2]。IL-28B即IFN-λ3，在动物体内以及细胞模型中均具有良好的抗HBV/HCV活性[3]，其基因多态性与HCV感染者的自发性病毒清除及IFN治疗诱导的病毒清除密切相关[4]。但IL28B基因多态性对HBV感染者的IFN疗效预测价值存在争议[5-7]，尚需在不同地域以及不同种族人群间进行深入研究。本研究以广西汉族人群为研究对象，探讨IL28B rs12979860不同基因型与HBeAg阴性CHB患者应用富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate,TDF）序贯或联合普通IFN-α疗效间的关系，从而为加深对慢性HBV感染免疫发病机制的理解以及指导临床治疗提供思路。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2016年1月—2019年12月在南宁市第四人民医院和北海市人民医院门诊或住院的119例初次接受TDF治疗有效并完成序贯或联合普通IFN-α抗病毒治疗的HBeAg阴性CHB患者作为研究对象。HBeAg阴性CHB的诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的标准。具体诊断标准为：血清HBsAg和HBV DNA阳性，HBeAg持续阴性，抗-HBe阳性或阴性，血清ALT反复或持续异常，或肝组织学检查有肝炎病变。纳入标准：①无其他肝脏疾病；②年龄＞18周岁；③用药依从性良好，能完成全程抗病毒治疗及随访观察。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 119例患者初始均给予TDF[葛兰素史克（天津）有限公司，规格300 mg，批号19055076]300 mg，1次/d，口服，且均达到HBV DNA持续检测不到水平。根据治疗144周时HBsAg水平进行个体化治疗分组。对于HBsAg≤1000 IU/ml者序贯应用普通IFN-α2b（北京凯因科技股份有限公司，规格1 ml∶500万IU，批号20191278）500万IU，隔日1次，皮下注射，连续用药48周；对于HBsAg＞1000 IU/ml者则联合应用普通IFN-α2b 500万IU，隔日1次，皮下注射，连续用药48周。所有患者根据治疗192周时HBsAg水平决定是否停药，停药者平均随访18（6～30）个月。停药标准：依据《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]推荐的停药标准，即HBeAg阴性CHB患者采用NAs治疗至少4年，HBV DNA阴转，HBV DNA持续检测不到超过3年，肝功能持续正常，HBsAg≤1000 IU/ml（HBsAg定量对HBeAg阴性CHB患者抗病毒治疗效果和停药后疗效预测方面具有一定的临床指导意义[9]）。

1.2.2 指标检测 采用PCR产物直接测序方法对患者IL28B rs12979860多态性进行测序分型：所有患者均采集外周血2 ml，用EDTA管收集并于-70 ℃冻存备用，采用离心柱法提取人基因组DNA，用PCR对基因进行扩增并进行产物纯化回收；采用BigDye Terminator v1.1试剂盒，通过ABI 3730测序仪对测序引物进行测序分型，利用3730 Fast System V1.3.1 SDS图像分析软件分析IL28B rs12979860多态性分型结果。采用肝脏瞬时弹性成像扫描仪（Fibroscan，法国Echosens公司）测量并记录受试者不同时间点的肝脏硬度测定值（liver stiffness measurement,LSM）。采用EasyCuta全自动时间分辨荧光分析仪（珀金埃尔默仪器有限公司）对患者不同时间点的HBV血清学标志物（抗-HBs、HBsAg、抗-HBe、HBeAg）进行定量检测。采用实时荧光定量PCR方法对患者不同时间点血清标本中HBV DNA含量进行检测，检测仪器采用ABI-7500实时荧光定量PCR扩增仪（美国应用生物系统公司）。

1.3 疗效判定 抗病毒治疗的病毒学应答、免疫学应答及组织学应答定义符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的标准。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计量资料用±s表示，计数资料用例（%）表示；计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者基线特征及不同IL28B rs12979860基因型患者的差别 119例患者的基线特征见表1。IL28B rs12979860 CC基因型和非CC基因型患者各基线特征比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表1 患者基线特征及不同IL28B rs12979860基因型患者的差别Table 1 Baseline characteristics of patients and differences in patients with different IL28B rs12979860 genotypes

2.2 治疗192周时不同IL28B rs12979860基因型患者血清学应答状况 治疗192周时HBsAg≤1000 IU/ml的患者比例为60.5%（72/119），其中4例发生HBsAg血清学转换。IL28B rs12979860 CC基因型患者中HBsAg≤1000 IU/ml者占65.7%（65/99），而非CC基因型患者中HBsAg≤1000 IU/ml者占35.0%（7/20），2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。治疗192周时，IL28B rs12979860 CC基因型患者HBsAg下降水平为（1.0±0.4）lg IU/ml，而非CC基因型患者仅为（0.8±0.3）lg IU/ml，2组比较差异有统计学意义（t=2.116，P=0.036），而且4例发生HBsAg血清学转换的患者均为CC基因型表达者。

表2 不同IL28B rs12979860基因型患者的血清学应答状况（例）Table 2 Serological response in patients with different IL28B rs12979860 genotypes(cases)

2.3 治疗192周时不同IL28B rs12979860基因型患者肝脏组织学应答情况 治疗192周时IL28B rs12979860 CC基因型患者LSM的平均下降水平为（3.4±1.3）kPa，而非CC基因型患者仅为（2.6±1.4）kPa，2组比较差异有统计学意义（t=2.788，P=0.015）。

2.4 IL28B rs12979860基因型与停药随访6个月时复发的关系 治疗至192周时，72例患者HBsAg≤1000 IU/ml，其中IL28B rs12979860 CC基因型患者65例，非CC基因型患者7例。停药随访6个月时有16例复发，CC和非CC基因型患者所占的比例分别为16.9%（11/65）及71.4%（5/7），2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同IL28B rs12979860基因型患者停药随访6个月复发情况（例）Table 3 Relapse of patients with different IL28B rs12979860 genotypes at 6-month follow-ups after drug withdrawal(cases)

2.5 IL28B rs12979860基因型与抗病毒治疗期间的药物不良反应间的关系 119例患者在抗病毒治疗期间的药物不良反应主要包括血乳酸升高、血磷降低、一过性骨髓抑制、甲状腺功能异常、食欲减退、体质量减轻及脱发等，对不同IL28B rs12979860基因型患者的上述药物不良反应发生率进行比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表4。

表4 不同IL28B rs12979860基因型患者抗病毒治疗期间的不良反应[例（%）]Table 4 Adverse reactions during antiviral therapy in patients with different IL28B rs12979860 genotypes[cases(%)]

3 讨 论

本研究结果表明，HBeAg阴性CHB患者应用TDF序贯或联合IFN-α可以获得较好的免疫学及组织学应答，IL28B rs12979860 CC基因型可能是 HBeAg阴性CHB患者取得抗病毒疗效及停药6个月不复发的预测因素。对NAs经治CHB患者序贯或联合Peg-IFN-α可有效提升抗病毒疗效，使部分患者获得临床治愈，并可以进一步降低HBV相关肝癌的发生率[1]。Tatsukawa等[10]研究表明，HBeAg阴性CHB患者应用NAs长期治疗期间，序贯以长效IFN治疗，对降低HBsAg水平的效果可能优于联合长效IFN治疗。本研究证实，TDF经治CHB患者序贯或联合IFN-α治疗至192周时，其血清学应答率为60.5%，有4例患者发生了HBsAg的血清学转换。

先前研究证实，IL28B rs12979860基因多态性不仅与HCV感染者的疾病转归，而且与病毒载量密切相关[4]。IL28B基因编码IFN-λ3，后者与IFN-α一样，也是通过激活JAK-STAT信号并最终通过活化ISGs在抗HBV/HCV感染免疫中发挥重要的作用[4]。而且，在转基因鼠肝细胞模型中，外源性IFN-λ2通过上调ISGs而发挥对HBV良好的抑制效应[11]。基于上述研究，推测IL28B基因多态性可能与慢性HBV感染者临床转归及IFN-α抗病毒疗效相关。但也有部分研究观点与该推测相矛盾。一项针对亚洲人群的Meta分析表明，IL28B基因多态性与HBV感染者疾病进程无相关性[12]。来自Jilg 等[13]的研究认为，IL28B基因多态性与IFN治疗CHB患者诱导的病毒清除间的关系较微弱，即使存在，可能也局限于某些亚组，如HBeAg状态或某种HBV基因型患者。而来自Domagalski等[14]研究则证实，IL28B基因多态性对IFN治疗儿童CHB效果具有良好的预测价值。

本研究以广西汉族人群为研究对象，探讨IL28B rs12979860多态性对HBeAg阴性CHB患者TDF序贯或联合IFN-α抗病毒疗效的影响。结果发现，序贯或联合IFN-α 48周后携带IL28B rs12979860 CC基因型患者的HBsAg下降水平及肝脏纤维化改善情况均显著优于非CC基因型患者；而且在达到停药标准的患者中，随访6个月时非CC基因型患者更容易复发。这与Wei等[7]的研究结果不同，该研究发现IL28B基因型与长效IFN治疗HBeAg阴性和阳性的CHB患者的效果均不相关。然而，一项来自北欧和亚洲的多中心研究表明，IL28B基因多态性与IFN诱导的HBeAg血清学转换及HBsAg血清学清除密切相关[5]。Lampertico等[6]通过研究HBV基因D型HBeAg阴性CHB患者采用IFN治疗的效果与IL28B rs12979860多态性间的关系证实，IL28B基因型不仅与IFN治疗结束时病毒学应答及持续病毒应答率相关，而且与长期随访的HBsAg血清学转换密切相关[6]。IL28B基因多态性与IFN诱导的CHB患者的病毒学及血清学应答关系尚不十分清楚，可能与优势等位基因纯合子基因型者高表达Ⅲ型IFN导致基线病毒水平较低相关。这与Vergori等[15]的研究结论相一致，该研究发现IL28B rs12979860 CC基因型患者HBsAg定量及HBV DNA水平显著低于非CC基因型患者。但目前关于IL28B基因多态性与IFN诱导的CHB患者的病毒学及血清学应答相关研究结论存在差异，可能与在不同的研究队列中纳入的种族人群、样本量大小、治疗策略及疗程以及随访时间不同有关，尚须进一步研究探讨。

此外，本研究还发现，应用NAs及IFN治疗期间的常见不良反应在IL28B rs12979860 CC基因型和非CC基因型患者之间差异无统计学意义。而Lotrich等[16]研究发现，IL28B rs12979860 C等位基因与IFN相关的乏力、食欲下降及失眠等不良反应密切相关。Miyamura等[17]研究则发现，IL28B rs8099917 G等位基因与Peg-IFNα-2a/利巴韦林治疗期间发生一过性骨髓抑制相关。这可能与种族人群的差异或HBV与HCV所诱导的宿主免疫应答不同所致，尚须深入研究。

总之，我国广西汉族人群的IL28B rs12979860基因多态性不仅与HBeAg阴性CHB患者TDF序贯或联合IFN-α治疗的血清学应答及组织学应答密切相关，而且与停药后6个月的是否复发相关。