AIDS患者高效抗反转录病毒治疗后25-羟基维生素D水平与T细胞亚群含量及病毒载量的关系

李松鹏，景红艳，尹光凤，雷黎明，刘寿芳

AIDS是由HIV感染而引起的慢性传染病，以机体免疫系统功能下降或抑制为特征，主要表现为CD4+T细胞水平和活性降低，异常免疫激活，机体因丧失了对外界病原体的防御功能易发生机会性感染，严重者可诱发恶性肿瘤等病变[1]。高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）能显著抑制HIV复制，进而提高患者CD4+T细胞水平，在目前临床指南推荐的规律治疗方案中，被认为是最有效的治疗方法[2]。维生素D在人体内可转变为多种类固醇激素，对人体的生长、代谢和免疫具有重要作用。人体内维生素D的正常含量不低于20～38 nmol/L，可通过检测血浆中25-羟基维生素D体现。有研究报道，1，25-羟基维生素D3（体内维生素D的活性形式）可通过诱导细胞自噬，从而对HIV复制发挥抑制作用[3]。以往多集中于研究HAART对AIDS疗效和CD4+T细胞的影响[4]，较少关注25-羟基维生素D与T细胞亚群及病毒载量的关系，因此本研究通过分析HAART后AIDS患者25-羟基维生素D水平、T细胞亚群及病毒载量的变化及相关性，进而为评估AIDS的治疗效果提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年6月—2019年12月昆明市第三人民医院诊治的128例AIDS患者作为研究对象。其中，男85例，女43例；年龄21～53岁，平均为40.28（28.11，46.19）岁；病程1～10年，平均为（4.73±1.56）年。纳入标准：①年龄＞18岁；②符合《艾滋病诊疗指南（第三版）》[5]的诊断标准并确诊为AIDS；③未接受过其他抗病毒治疗方案；③临床病历资料完整；④患者及家属均知情，签署同意书并能积极主动配合本研究。排除标准：①合并机会性感染及其他血液免疫疾病；②合并其他脏器功能障碍性疾病；③合并恶性肿瘤；④对所用药物有禁忌证；⑤治疗过程中出现严重不良反应；⑥有心理、精神疾病；⑦妊娠女性。本研究经我院医学伦理委员会批准同意。

1.2 治疗方法 患者入院完善相关检查后均接受规律HAART。具体方案如下：拉米夫定[葛兰素史克制药（苏州）有限公司，国药准字H20030581，规格0.1 g]，300 mg/次，1次/d；齐多夫定（上海现代制药海门有限公司，国药准字H20163036，规格0.3 g），300 mg/次，2次/d；奈韦拉平（上海迪赛诺制药有限公司，国药准字H20020580，规格0.2 g），200 mg/次，1次/d。研究发现该方案转阴率较高（85.7%）[6-7]，因此采用该方案持续治疗12个月，不定期对患者进行随访，期间每隔6个月采集患者外周血进行检测。根据《艾滋病诊疗指南（第三版）》[5]对抗病毒疗效进行评定。病毒抑制率指标：HAART后3～6个月HIV载量达到检测不到水平。病毒学失败标准：持续HAART 12个月后血浆HIV载量持续＞200拷贝/ml。免疫学应答标准：HAART 12个月后CD4+T细胞计数较基线增长≥100个/μl。

1.3 25-羟基维生素D水平测定 分别于治疗前和治疗后1年，采集患者空腹静脉血2 ml，采用BECKMAN AU5400全自动化学分析仪（美国贝克曼公司）及北京九强生物技术公司试剂，严格按照说明书，经免疫比浊法测定25-羟基维生素D水平。

1.4 T细胞亚群含量测定 分别于治疗前和治疗后1年，采集患者空腹静脉血3 ml置于TDTA-K2抗凝管中，从各抗凝管中分别取100 μl抗凝血至已编号的流式管中，分别加20 μl荧光标记的单克隆抗体CD3-PC5、CD4-PE以及CD8-FITC，震荡混匀，避光作用20 min，各加2 ml红细胞裂解液后震荡混匀，并避光作用10 min，1000 r/min离心5 min后弃上清，加适量生理盐水重悬细胞，再次离心后弃上清，各加0.5 ml生理盐水将细胞重悬，用BECKMAN COULTER流式细胞仪（美国贝克曼公司）检测CD3+T细胞、CD4+T细胞以及CD8+T细胞，获取的数据采用System U软件分析。

1.5 病毒载量测定 分别于治疗前和治疗后1年，采集患者空腹静脉血2 ml，采用COBAS AmpliPrep全自动PCR分析仪及HIV-1 Monitor1.5商品化试剂盒（瑞士罗氏公司）严格参照说明书进行测定，定量分析血浆中HIV RNA，以每毫升血浆含病毒拷贝数的形式表示结果，最低检测限为50拷贝/ml。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。计量资料呈正态分布以±s表示，比较采用自身配对t检验；呈非正态分布以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较采用Wilcoxon符号秩和检验。指标间相关性分析采用Spearman分析。以α=0.05为检验水准，双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗前后25-羟基维生素D、T细胞亚群含量及病毒载量变化 128例AIDS患者治疗后25-羟基维生素D、CD3+T细胞、CD4+T细胞水平及CD4/CD8比值均升高，CD8+T细胞、HIV RNA水平降低，与治疗前相比，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 治疗前后25-羟基维生素D、T细胞亚群含量及病毒载量变化Table 1 Changes of 25-hydroxyvitamin D,T cell subsets and viral load before and after treatment

2.2 治疗后不同25-羟基维生素D水平患者的情况 根据治疗后25-羟基维生素D水平，将患者分为25-羟基维生素D＜30 ng/ml组和≥30 ng/ml组。25-羟基维生素D≥30 ng/ml组的CD3+T细胞、CD4+T细胞水平以及CD4/CD8比值明显高于25-羟基维生素D＜30 ng/ml组，CD8+T细胞、HIV RNA水平明显低于25-羟基维生素D＜30 ng/ml组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 治疗后不同25-羟基维生素D水平患者的情况Table 2 Patients with different 25-hydroxyvitamin D levels after treatment

2.3 治疗后不同CD4+T细胞水平患者的情况 根据治疗后CD4+T细胞水平不同，将患者分为CD4+T细胞＜500个 /μl组和≥500个 /μl组。CD4+T细胞≥500个/μl组的25-羟基维生素D、CD3+T细胞水平以及CD4/CD8比值明显高于CD4+T细胞＜500个/μl组，CD8+T细胞、HIV RNA水平明显低于CD4+T细胞＜500个/μl组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表3。

表3 治疗后不同CD4+ T细胞水平患者的情况Table 3 Patients with different CD4+ T cell levels after treatment

2.4 治疗后不同HIV RNA水平患者的情况 根据治疗后HIV RNA水平不同，将患者分为HIV RNA＜400拷贝/ml组和≥400拷贝/ml组。HIV RNA＜400拷贝/ml组的25-羟基维生素D、CD3+T细胞、CD4+T细胞水平以及CD4/CD8比值明显高于HIV RNA≥400拷贝/ml组，CD8+T细胞水平明显低于HIV RNA≥400拷贝/ml组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表4。

表4 治疗后不同HIV RNA水平患者的情况Table 4 Patients with different levels of HIV RNA after treatment

2.5 治疗前后25-羟基维生素D、T细胞亚群及HIV RNA间的相关性 采用Spearman分析分别对治疗前和治疗后的25-羟基维生素D、T细胞亚群及HIV RNA水平进行相关性分析。结果表明，治疗前，25-羟基维生素D水平与CD3+T细胞（r=0.219，P=0.001）、CD4+T细胞水平（r=0.570，P=0.003）及CD4/CD8比值（r=0.409，P=0.000）呈正相关，与CD8+T细胞（r=-0.387，P=0.005）和HIV RNA水平（r=-0.629，P=0.008）呈负相关。HIV RNA水 平 与 CD3+T细 胞（r=-0.548，P=0.000）、CD4+T细胞水平（r=-0.579，P=0.006）及CD4/CD8比值（r=-0.624，P=0.001）呈负相关， 与 CD8+T细 胞 水 平（r=0.671，P=0.002）呈正相关。治疗后，25-羟基维生素D水平与CD3+T细 胞（r=0.547，P=0.008）、CD4+T细胞 水 平（r=0.821，P=0.000） 及 CD4/CD8比 值（r=0.630，P=0.005）呈正相关，与CD8+T细胞（r=-0.295，P=0.009）和HIV RNA水平（r=-0.460，P=0.001）呈负相关。HIV RNA水平与CD3+T细胞（r=-0.702，P=0.004）、CD4+T细胞水平（r=-0.681，P=0.006）及CD4/CD8比值（r=-0.729，P=0.007）呈负相关，与CD8+T细胞水平（r=0.392，P=0.008）呈正相关。

3 讨 论

CD4+T细胞是HIV感染的主要靶细胞。HIV通过识别CD4+T细胞表面的特异性蛋白分子而侵入细胞内，并将自身基因整合到细胞DNA上，进而随着细胞增殖而复制繁殖，但CD4+T细胞会在HIV破壁而出时发生凋亡，进而无法将抗原信息递呈给CD8+T细胞，导致CD8+T细胞无法有效发挥毒性作用，最终导致多种固有免疫细胞及获得性免疫细胞均受到损害[8]。近年来临床上多推荐HAART方案用于AIDS的治疗，即将3种或3种以上的抗反转录病毒药物联合使用，通过对HIV复制周期的多个环节进行阻断，以最大程度地抑制HIV复制，降低病毒载量，进而使CD4+T细胞水平升高[9]。

目前，HIV载量和CD4+T细胞是评估AIDS病情、临床用药效果以及预后的重要检测指标[10]。胡水秀等[11]分析发现，HAART后第1年CD4+T细胞水平迅速升高，尽管之后升高幅度逐渐减小，但升高可持续至第5年，提示长期抗病毒治疗能使AIDS患者的免疫功能持续恢复，应加强患者HAART后首年的预后管理，以及早取得免疫学效应的最大化。因此，本研究主要分析HAART后1年的数据，结果表明HIV RNA、CD3+T细胞、CD4+T细胞水平、CD4/CD8比值变化符合早期多项报道[12]。关于CD8+T细胞，有资料显示HAART前后无明显差异，也有资料表明治疗后其水平下降[13]，本研究结果与后者一致，可能跟HAART方案的差异及样本量不同有关[14-15]。

近年来研究发现，25-羟基维生素D既能调节钙磷代谢，又参与了细胞增殖分化、炎症反应以及机体免疫平衡[16]。多项研究证实，25-羟基维生素D与系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化病等某些自身免疫性疾病的发生有关[17-19]。本研究发现HAART后AIDS患者的25-羟基维生素D水平升高，表明25-羟基维生素D与AIDS关系密切。25-羟基维生素D中约95%的成分为25-羟基维生素D3，活化的维生素 D通过结合T细胞上的维生素D3受体，对抗原提呈细胞以及一系列细胞因子发挥作用，进而对T细胞功能进行调节，诱导T细胞增殖[20]。欧阳福等[21]对乙型肝炎肝硬化患者的研究表明，25-羟基维生素D水平与CD3+T细胞水平呈正相关，提示机体细胞免疫功能与维生素D有关，补充维生素 D可能对患者细胞免疫功能的提高、免疫状态的恢复有利。邹光美等[22]研究认为，系统性红斑狼疮患者25-羟基维生素D水平与CD4+T细胞水平呈正相关。本研究对AIDS患者治疗后的分析中，除了发现25-羟基维生素D水平与CD3+T细胞、CD4+T细胞水平呈正相关外，还发现AIDS患者治疗后25-羟基维生素D水平与CD4/CD8比值呈正相关，与CD8+T细胞和HIV RNA水平呈负相关；HIV RNA水平与CD3+T细胞、CD4+T细胞水平及CD4/CD8比值呈负相关，而与CD8+T细胞水平呈正相关。CD8+T细胞、CD4/CD8与25-羟基维生素D及HIV RNA水平之间的相关性结果与以往报道的不完全一致[23]，可能由HAART方案差异及样本量不同所致；而HIV RNA水平与25-羟基维生素D、CD3+T细胞、CD4+T细胞水平之间的相关性结果符合早期研究结果[24]，也与各指标的相互作用机制一致。

综上所述，AIDS患者HAART后，25-羟基维生素D水平与CD3+T细胞、CD4+T细胞水平及CD4/CD8比值呈正相关，与CD8+T细胞、HIV RNA水平呈负相关，提示通过HAART在降低病毒载量的同时，或可通过补充维生素D以提高AIDS患者的细胞免疫功能，促进机体免疫系统的重建。本研究的不足之处：由于为横断面研究导致无法纵向观察HAART后的病毒学应答以及对25-羟基维生素D、T淋巴细胞亚群的影响；未量化日常饮食中维生素D的含量，未排除季节的影响；仅收集了一种HAART方案后的临床数据，未对行其他HAART方案后的临床数据进行分析。今后仍须进一步加大样本量，扩大研究层面以期获得更加可靠的研究结果。