早发性卵巢功能不全的动物模型构建

伏玉洁，孙小燕，张学红

卵巢是女性主要的内分泌和生殖器官。在青春期双侧卵巢约有40万个原始卵泡。卵泡在女性35岁后消耗速度加快，到40岁时仅剩余25 000个[1]。在既定范围内与年龄相符的功能性卵巢储备下降称为生理性卵巢衰老（normal ovarian aging，NOA）。大约有1%的女性会在40岁前出现卵巢内卵泡提前耗竭，月经稀发或闭经＞4个月，间隔4周的2次血清卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）水平均＞25IU/L，称为早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）。而POI的更严重阶段为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），表现为40岁以前出现闭经、FSH＞40 IU/L、雌激素水平降低，并伴有不同程度的围绝经期症状[2-3]。卵泡的消耗速度在女性之间有个体差异，取决于许多因素，如遗传、年龄、药物和环境等。POI影响全身多个系统和器官，导致相关疾病和综合征的发生[4]。主要表现为月经失调、潮热、关节疼痛和失眠等不适。POI患者自发受孕的机会非常有限，受孕可能性在4%～8%[5]。POI的治疗方法包括激素替代、补充褪黑激素、免疫调节和干细胞治疗等[6]。虽然促排卵治疗、辅助生殖技术、赠卵和移植卵巢组织等技术也给有生育要求的POI患者带来生殖希望，但都不能从根本上治疗POI。目前，研究POI的发病机制及治疗方式主要依据POI动物模型，结合当前研究现状和已发表文献，本文对常见模型做一总结。

1 免疫反应诱导的POI模型

自身免疫性卵巢疾病（autoimmune ovariandisease，AOD）是POI的常见病因之一，约占20%，常与循环中的抗卵巢抗体有关[7]。理论上免疫应答可以靶向作用于卵泡颗粒层、卵泡膜和透明带等卵巢成分。POI患者同时伴有一种或多种自身免疫性疾病，其中自身免疫性POI与原发性肾上腺皮质功能不全的伴发率高达10%～23%。目前认为POI不仅是一种自身免疫性疾病，也可能是全身自身免疫性疾病累及卵巢后的表现[8]。免疫反应致POI的造模成功率高，方法简单，主要用于免疫原因与卵巢功能不全的研究。

1.1 透明带3多肽（zona pellucida glycoprotein 3，pZP3）构建POI模型pZP3引起B6AF1（4周龄）、BALB/c和C57BL/6小鼠（7～8周龄）实验性自身免疫性卵巢炎（experimentalautoimmuneoophorits，EAO）[7，9-10]。制备过程：具有正常动情周期的小鼠皮下注射经过完全弗氏佐剂乳化，浓度为50 nmol/L的pZP3，0.16 mg/小鼠，2周后皮下注射经不完全弗氏佐剂乳化的，相同剂量的pZP3。1周后根据血清抗透明带抗体（anti zona pellucida antibody，AZPAb）证实免疫反应，如为阳性，提示造模成功[9]。此外，从给药当天至实验结束小鼠安乐死日，每日行阴道细胞学检查，当出现不规则的动情周期也可反映造模成功[10]。处死小鼠后观察卵巢形态并计数卵泡（卵巢纤维化加剧，卵泡数量减少），以及比较实验前后血清FSH水平升高，雌二醇（estradiol，E2）水平下降也可提示造模成功[9-10]。利用此模型发现人胎盘间充质干细胞[9-10]、人羊膜上皮细胞[7]对自身免疫性POI小鼠的卵巢功能具有恢复作用。

1.2 新生胸腺摘除小鼠诱发EAO先天无胸腺小鼠具有垂体-性腺轴发育异常、延迟性成熟、生育力低下和生殖期较短的特征。新生小鼠在出生后第2～5天行全胸腺摘除术，在术后第28天可检测到卵巢自身抗体。在术后第4～14周卵巢产生伴随卵泡闭锁的EAO。在术后14周活动性炎症消退后，发生卵巢萎缩。通过此模型发现从免疫功能损害发生到卵巢组织学改变存在较明确的窗口期（即术后1～4周）[11]，在术后早期阶段足够数量的调节性T细胞可以改善AOD的卵巢损害[12]。上述发现为AOD的早期治疗与预防提供了重要线索。

1.3 用抑制素α的p215-245肽免疫SWXJ雌性小鼠诱导的EAO6～8周龄SWXJ雌性小鼠经腹部皮下注射200 μg的抑制素α的p215-245肽，免疫后7～9周的小鼠表现为生育力显著提高，而免疫后43～45周时，卵巢组织显著萎缩，免疫反应减少了抑制素介导的FSH释放的下调，加速卵泡池耗竭[13]。这对于理解人类POI的发生和开发用于治疗自身免疫介导的不育症的有效替代疗法具有重大意义。

2 化学治疗药物诱导的POI模型

化疗药物模型是研究POI的经典模型。化疗药的非选择性分布给身体各器官系统带来诸多毒副反应。化疗对性腺的影响因所患疾病的类型、药物种类、用药方案和累积剂量等因素的不同而不同[14]。最近的研究揭示了化疗药物如何影响卵巢的不同细胞成分，诱导原始卵泡死亡、损害血管与基质腔室、加速卵泡活化及增加卵泡闭锁[15-19]。

环磷酰胺（Cyclophosphamide，CPA）单次腹膜内注射（150 mg/kg）到出生后第5天的3种品系（CD-1，C57BL/6J和BALB/cJ）小鼠，分别在第1、3和7天后摘取卵巢组织。发现CPA特异性诱导原始卵泡凋亡，不会将原始卵泡激活到生长卵泡池中。卵巢组织体外培养实验发现CPA代谢产物4-HC通过激活细胞凋亡途径破坏原始卵泡，凋亡抑制剂（ETP-46464和CK2II）可保护卵泡免受4-HC在体外的损害作用[15]。这为进一步研究对抗化疗药物毒性作用的候选性腺保护剂提供了新的思路。

在6周龄的雌性瑞士小鼠单次腹膜内注射CPA（150 mg/kg） 伴或不伴重组抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH，0.5 mg/kg），分别在给药后24 h和第8天摘取卵巢组织。发现CPA通过磷脂酰肌醇激酶（PI3K)/磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）/蛋白激酶（AKT）信号通路使卵泡募集增加。AMH可通过抑制叉头转录因子O3a（FOXO3a）的磷酸化和核输出，减少CPA引起的原始卵泡的活化[16]。CPA（75 mg/kg）和AMH（0.5 mg/kg）联合治疗小鼠4周，发现共同用药可以改善CPA治疗小鼠的繁殖力。由于AMH仅由卵巢产生，并通过由卵巢表达的特异性受体起作用，因此AMH可能是保护卵巢储备和提高生育力的靶向治疗药物[16]。

6周龄的C57BL/6雌性小鼠经腹腔连续注射顺铂（2～2.5 mg/kg）7 d可诱导POI发生，通过动情周期与卵巢组织学变化判断成模[17]。造模期间4-苯基丁酸（150 mg·kg-1·d-1）与顺铂的同时给药，发现4-苯基丁酸通过减轻内质网应激来防止顺铂诱导的颗粒细胞凋亡和卵巢损伤[17]。5周龄的雌性CD-1小鼠经腹腔连续注射顺铂（2 mg/kg）伴或不伴褪黑素（15～30 mg/kg）治疗15 d，发现褪黑素通过抑制小鼠卵巢中的PTEN/AKT/FOXO3a途径激活来防止顺铂诱导的原始卵泡丢失[18]。

在3周龄CD-1雌性小鼠单次腹膜内注射剂量为10 mg/kg的蒽环类抗生素多柔比星（doxorubicin，DOX），发现DOX通过原始卵泡闭锁和过度激活来降低卵巢储备功能。通过与5日龄、8周龄小鼠比较，发现DOX具有年龄依赖性的卵巢毒性作用。故临床用药需着重考虑癌症治疗期间使用DOX增加年轻女性癌症患者POI的发生风险，需重点预防原始卵泡的闭锁和过度活化以保存生育力[19]。

在8周龄的Wistar雌性大鼠的动情周期第1天，经腹腔注射白消安（36 mg/kg），在给药4周后摘取卵巢组织通过组织病理学与血清学检测判断POF成模。通过此模型发现人子宫内膜间充质干细胞（经尾静脉注射），主要通过迁移至未成熟卵泡的颗粒细胞层并分化为颗粒细胞，进而改善卵泡发育和激素的分泌[20]。这为干细胞移植治疗POI提供了新的实验依据。

化疗导致POI模型的效果与化疗剂量及持续时间有关，随着化疗时间延长，卵巢功能有自然恢复的可能性，不适合进行长期的探索性研究。但随着模型动物体内外实验对细胞毒性药物的深入研究，新的生育力保存方法不断被开发，这些研究有助于进一步了解卵巢损伤的机制和途径。

3 放射治疗诱导的POI模型

POI是癌症放疗的常见远期并发症。经过X射线放疗后，卵巢较全身其他器官损伤严重，在人和动物其严重程度均取决于辐照剂量和年龄，年龄越小，卵巢对放疗越敏感，损伤也越大。8周龄的C57BL/6J小鼠以4 Gy为最低适宜剂量，单次全身X射线辐照后7～14 d能够成功建立小鼠POI模型[21]。8 Gy的γ-射线单次全身辐照后20 d内无一例小鼠存活[22]。以小鼠的体质量、卵巢湿质量、激素水平、卵泡计数，以及全身各脏器形态学变化和动情周期变化判断成模[21]。通过以上模型发现曲酸在体内和体外均具有显著的放射防护作用[22]。该造模时间短、成功率高、死亡率低，为探讨放疗致POI的病理表现和发病机制提供了较可靠的实验动物模型。

4 基因突变与基因编辑构建的POI动物模型

遗传因素在女性POI中占20%～25%[23]。最常见的遗传因素是X染色体连锁缺陷，如特纳综合征[24]。单基因异常，包括X染色体上的基因如骨形态发生蛋白15（BMP15）基因[24-25]、脆性X智力低下1（FMR1）基因[26]和常染色体上的基因，如生长分化因子9（GDF9）基因[25]、新生儿卵巢同源盒（NOBOX）基因[24]、雌激素受体1（ESR1）基因[24]和卵泡刺激素受体（FSHR）基因[27]与POI呈正相关。在POI谱系中分离出的POI致病基因主要参与DNA损伤修复、同源重组和减数分裂，包括安乐乡综合征B-PiggyBac转座子3（CSBPGBD3）融合基因、微小染色体微粒蛋白8（MCM8）基因、错配修复蛋白5（MSH5）基因和基质抗原3（STAG3）基因等[28]。

对于FMR1基因敲除小鼠（FMR1-/-）的研究已二十余年，FMR1-/-小鼠表现出因原始卵泡的活化增加的生育力过早下降。FMR1-/-小鼠雷帕霉素靶蛋白（mTOR，PI3K途径中的一种蛋白激酶）活性升高。经雷帕霉素（mTOR拮抗剂）治疗的FMR1-/-小鼠的卵巢表型和蛋白质水平发生逆转，以及经雷帕霉素治疗的野生型小鼠的生殖寿命延长，表明mTOR途径是潜在的POI治疗靶点[26]。ESR1基因敲除小鼠表现出因卵泡成熟受损的生育力过早丧失，ESR1基因被认为是POI的潜在候选基因[24]。NOBOX基因敲除小鼠的POU结构域5类转录因子1（POU5F1）基因被显著下调，使NOBOX基因成为研究POI的理想基因[24]。Basonuclin-1（BNC1）基因突变小鼠表现为POI，并通过该模型验证了Basonuclin-1缺乏症是人类常染色体显性遗传POI的遗传原因[29]。WD重复区域62（Wdr62）基因敲除小鼠因卵母细胞减数分裂起始缺陷发生POI，并在POI患者中检测到Wdr62突变，发现Wdr62基因与人类POI相关[30]。乳腺癌易感基因2（BRCA2）缺陷小鼠因卵泡发育受抑制及DNA损伤致卵母细胞的质量缺陷发生POI。BRCA2缺陷型卵母细胞中异位表达BRCA2可以部分恢复卵母细胞的发育和染色体稳定性，提示BRCA2缺乏可能是人类POI的潜在驱动因素，为BRCA2缺乏诱导的POI患者提供了潜在的生育治疗策略[31]。精卵生成碱性螺旋-环-螺旋转录因子2（Sohlh2）基因敲除小鼠因卵母细胞在早期发生过程中的分化受到损害而表现为POI[24]。生殖细胞特异性Atg7基因敲除小鼠品系，表现出因自噬破坏的严重卵泡丢失和生殖功能缺陷[32]。杂合的Fanca基因功能丧失小鼠（Fanca+/-）[28，33]、BMP15基因[24-25]、GDF9基因[25]敲除小鼠表现为POI。

POI是高度异质性的，POI的动物模型已成功用于鉴定该疾病的候选基因，已鉴定出80多个候选基因，其中约25%的基因表现出致病作用[30]。只有极少数（例如FMR1[26]、BMP15[25]、GDF9[25]和FSHR[27]）被用作诊断的生物标记物，这些基因可能是基因治疗的好靶标。随着目前基因编辑技术的快速发展，尤其是常间回文重复序列丛集/关联蛋白（CRISPR/Cas）系统更容易构建各种物种的基因敲除/敲入动物模型，为新的POI基因突变动物模型制作提供了良好的技术支持。针对已有和新发致病基因的定点和定时诱导发病模型，是未来精准复制动物模型构建的大趋势，可提高我们关于人类疾病病理进程的认识，帮助探索有效的治疗策略。

5 连续超排卵诱导卵巢衰老加速模型

对于啮齿类动物，使用孕母马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）反复诱导超排卵，以前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）溶解黄体[34]。制备过程：7～8周龄的C57BL/6雌性小鼠经腹腔注射5 IU的PMSG，48 h后经腹腔注射5 IU的hCG，19 h后经腹腔注射25 IU的PGF2α。3种药物注射完成则组成一个完整的促排卵周期，下一个周期开始于12 h后，进行连续超排卵（continuous superovulation，CS）。判断标准：超过10次CS模型小鼠的卵巢指数降低，原始卵泡池和卵巢功能均明显下降，窦卵泡数量增加，凋亡细胞的数量显著增加。CS15次组和自然衰老组（44周龄的C57BL/6小鼠）之间的卵泡数量无显著差异。故连续10次以上CS建立了POI小鼠模型。通过该模型发现CS涉及p16和沉默信息调节因子2相关酶1/叉头框蛋白O1（SIRT1/FOXO1）信号通路，增加氧化应激和卵巢细胞凋亡，进而降低卵母细胞质量和卵巢功能[34]。张金金[35]在以上CS 10次造模的基础上联合臭氧吸入建立卵巢衰老加速模型。区别于上述造模方法之处在于注射PGF2α的5 h后，开始下一次促排卵，共10个周期，期间运用定时开关，将小鼠每日暴露于臭氧的时间控制在10 h，臭氧浓度稳定在1.2 mg/m3，成模判断标准同前。通过此模型发现复方坤泰胶囊可能通过抗氧化应激、抗凋亡机制延缓卵巢衰老。该模型既有效模拟了自然状态下卵巢衰老的两大典型特征（卵泡数量减少和质量下降），又造成模型小鼠卵巢内分泌和生殖功能急剧下降，且模型在短期内不会自然恢复，有利于开展卵巢衰老绝经领域的探索性研究。

6 D-半乳糖诱导的POI模型

糖化是内源性衰老的机制之一，D-半乳糖皮下注射是衰老造模的经典方法。患有半乳糖血症的妇女最终进展为POI。半乳糖及其衍生物的毒性作用于卵巢及周围组织是造成卵巢病理性损伤的原因之一。造模方法：7～8周龄的C57BL/6雌性小鼠连续42 d经皮下注射D-半乳糖（200 mg·kg-1·d-1）。第42天模型小鼠体质量增长缓慢，卵巢指数降低，E2明显下降，FSH明显升高；卵巢形态学表现为卵巢空泡化明显，闭锁卵泡增多，提示成功构建POI小鼠模型[36]。缺点：模型小鼠血清AMH、雄激素均增高，与卵巢衰老特征不符，因此不模拟卵巢衰老真正的病理生理条件。模型构建是药物研究的基础，通过此模型发现人参皂苷Rg1能靶向调控卵巢组织中沉默信息调节因子2相关酶1的表达而发挥延缓卵巢衰老的作用[37]。另有研究发现姜黄素通过核转录因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶（HO-1）和PI3K/Akt信号通路可有效抑制D-半乳糖诱导的氧化应激、凋亡及卵巢损伤[36]。这对于发现潜在的POI保护剂具有重要意义。

7 环境化学毒物诱导卵巢衰老加速模型

4-乙烯环己烯二环氧化物（4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD）是工业化学物质，能选择性地破坏雌鼠和灵长类动物的原始卵泡和初级卵泡，具有卵巢毒性，在毒性研究中常被用作阳性对照。造模方法：21日龄SD雌性大鼠经腹腔注射VCD（160 mg/kg），持续15 d。可成功构建以卵巢成熟卵泡减少、闭锁卵泡显著增加和AMH水平明显降低为特征的POI模型[38]。通过此模型发现护阳养坤方通过Hippo-Janus蛋白酪氨酸激酶2（Hippo-JAK2）/信号转导和转录活化因子3（STAT3）信号通路，改善POI大鼠的卵巢功能障碍并增强其卵巢功能[38]。VCD模型选择性作用于始基和初级卵泡，加速始基卵泡池的激活和耗竭，进而加速卵巢衰老，最终在激素水平和动情周期等方面能模拟人类绝经前、绝经过渡早期、过渡晚期以及绝经后的不同状态。理论上非常适用于进行药物实验研究，但是由于衰老程度太快且不可逆，实际研究中应用较少。日常生活中通常单纯暴露于一种环境化学毒物的机会比同时暴露于多种的情况少见，目前的研究越来越倾向于研究多个化学毒物联合暴露后对卵巢等器官功能的影响，规避环境化学毒物对身体的损害显得尤为重要。

8 结语

人类疾病动物模型作为重要的研究工具，在人类疾病的发生机制研究、防治药物开发、诊断方法筛选等方面起着不可替代的作用。在POI的研究中，已经建立了大量的动物模型，其中免疫反应、放化疗、D-半乳糖是构建POI的经典方法。这些方法侧重于不同的病因学，均有着各自的独特性和局限性。基因敲除/敲入动物模型是未来精准复制动物模型构建的大趋势，也存在外源性基因表达不稳定可能、造模费时、费用高等缺陷。卵巢衰老加速模型对于绝经领域的探索性研究具有重要意义。环境化学毒物对生殖内分泌的影响也逐渐成为关注的热点。本文只列举了几种常见的POI模型，另外制动应激、高血压、其他药物如氢化可的松等也可致POI。POI的动物模型判断标准除了血清激素水平和卵泡方面，目前多是生育功能方面的研究。在未来的研究中，可以考虑对POI模型的基因学和细胞组织学等方面进行定性、定量分析，也可以考虑多种因素造模法，各种模型制备方法相结合、取长补短、优势互补。这些方法是否可行，是否能通过对比找出理想的POI动物模型有待于以后的研究。目前多数处于基础科研阶段，后期临床应用的安全性和可靠性有待进一步证实。延缓卵巢衰老、防治各因素导致的卵巢损伤仍任重而道远。