免疫因素在反复种植失败中的研究进展

周羽西，谢奇君，沈嵘，凌秀凤，赵纯

随着辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的发展，尽管临床选择高质量的胚胎植入子宫以提高临床妊娠率，但仍然有很多患者反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF），RIF至今还没有一个普遍接受的定义，争议主要在于移植胚胎周期数、移植胚胎质量和数量、移植胚胎周期类型及年龄[1]。一项荟萃分析提出，RIF应是在连续2个及以上周期的体外受精（in vitro fertilization，IVF）/胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）或冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）后没有着床，其中累计移植的卵裂期胚胎数≥4个，囊胚胚胎数≥2个，且所有胚胎均为优质胚胎[2]。

RIF的病因主要包括子宫内膜容受性降低、胚胎质量缺陷（如异常受精）、女性高龄、子宫异常、子宫内膜异位症和输卵管积水等，排除以上这些原因，仍无法成功妊娠，则称为不明原因RIF。免疫因素可通过降低子宫内膜容受性而导致着床失败，其可能是不明原因RIF的重要发病机制。RIF的免疫因素主要包括免疫耐受失衡和自身抗体的存在。妊娠是对母体免疫系统的一个重大挑战，因为妊娠必须耐受父亲同种抗原的持续存在，成功的妊娠依赖于母体免疫系统对胚胎产生免疫耐受，即母胎免疫耐受，许多不明原因RIF可能与母胎界面免疫耐受异常有关，这使得免疫耐受缺陷理论成为可能。近年来，越来越多的证据表明，生殖功能障碍可能与多种自身免疫性疾病有关，如抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮等。不论临床是否存在自身免疫性疾病，血清自身抗体如抗磷脂抗体、抗甲状腺抗体或抗核抗体可能与不孕症直接相关。本文总结了与RIF相关的免疫因素，就RIF免疫学发病机制及治疗的进展进行综述。

1 免疫耐受失衡

1.1 自然杀伤（natural killer，NK）细胞固有免疫细胞特别是巨噬细胞（macrophages，MΦ）、树突状细胞（dendritic cells，DC）和子宫自然杀伤（uNK）细胞群，大量存在于着床时的黄体期蜕膜中，以NK细胞为主。据报道，在RIF妇女中黄体期外周血自然杀伤（pNK）细胞的百分比显著增加[3]。早期胚胎植入部位底蜕膜的uNK细胞分泌大量因子，这些因子在早期蜕膜中介导血管生成以增强子宫动脉血流量，但异常增加的uNK细胞可能对子宫内膜容受性产生负面影响，引发过度氧化应激，从而导致胚胎植入失败。但也有研究者认为外周血CD3-CD56+NK细胞水平与植入失败或流产无关，不应作为RIF治疗的推荐指标[4]。Chernyshov等[5]在取卵后立即取子宫内膜标本，子宫内膜活检前25～30 min同时采集外周血，结果发现子宫内膜CD3-CD56+NK细胞水平高于外周血。因此，在RIF人群中检测pNK和uNK细胞对妊娠结局的预测价值仍然不确定。

1.2 MΦ和DCMΦ和DC是最主要的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）。子宫内膜APC最先与胎儿抗原接触，在妊娠期母胎免疫调节中发挥重要作用。DC是免疫应答的重要启动和调节者，其作为免疫系统中最强大的APC，不仅参与初始免疫应答的启动，而且在诱导免疫耐受和调节T细胞介导的免疫应答中起重要作用。与外周血单核细胞相比，MФ具有抗原提呈、免疫抑制活性和产生白细胞介素1（interleukin 1，IL-1）的能力。MФ影响早孕子宫内膜细胞内膜生化事件，促进子宫容受性，促进胚胎附着和着床。M1型MФ促进早孕胚胎着床，并积极参与保护胎儿免受宫内感染、宫颈成熟和分娩，而M2型MФ为胎儿在整个妊娠过程中在子宫内分娩提供了一个免疫耐受环境[6]。

1.3 补体系统补体系统是先天免疫防御系统的一部分，以补体组分3（complement component 3，C3）为代表的补体系统是一种血浆蛋白水解酶级联反应体系，为固有免疫的上游调节因子。反复流产、早产、宫内生长受限和子痫前期等妊娠并发症与补体过度激活有关，而补体级联的阻断可能导致妊娠结局的改善[7]，但仍需要随机对照试验来验证。而C3表达降低对胎盘发育和胎儿发育的不利影响已在C3缺陷小鼠中被证实[8]。因此，保持C3的平衡非常必要，C3的低表达和过表达可能都是有害的。

1.4 T淋巴细胞在妊娠早期，T淋巴细胞占蜕膜免疫细胞的10%～20%，其在成功着床中起着重要作用，当辅助T细胞1（T helper 1，Th1）、Th2、Th17和调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）之间达到平衡时，才能成功着床。

有研究表明，Th1 细胞因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2对妊娠有不良影响，而Th2细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10对妊娠有积极影响。Th1/Th2比值在控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）期间波动，可能影响IVF的妊娠结局，Th1/Th2比值的升高对胚胎的细胞毒性可能增加，导致植入失败[9]。Th1/Th2比值有可能成为检测不孕妇女子宫内膜和移植胚胎之间免疫排斥反应的一个有用指标。

Tregs是CD4+T细胞的一个亚群，Tregs通常占小鼠和人类外周CD4+T细胞的5%～15%，特异性分子标记为CD25。Foxp3是Tregs的特异性转录因子，通过阻止自身抗原的免疫反应和自身免疫反应在维持免疫耐受中起主导作用。RORγt是调节Th17细胞分化的最重要的转录因子。Th17细胞可能负责Th1或Th2免疫不能解释的炎症过程，Tregs在对抗Th17细胞等效应细胞方面起着关键性调节作用。胚胎植入时，由Tregs介导的母体免疫耐受的活跃状态是必不可少的。Tregs数量不足或功能不充分与特发性不孕、复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）有关[10]，Tregs的缺陷引发了由于胎儿免疫排斥而导致的妊娠失败。基因表达分析显示，与RIF患者相比，Foxp3基因在可育妇女中高表达，RORγt的表达水平较低。相反，与可育妇女相比，RIF患者RORγt的表达水平较高，Foxp3基因在可育妇女中低表达[11]。既往研究报道RSA患者植入窗口期间Th17/Tregs比值升高[12]，提示Th17/Tregs失衡与RIF发病有关，可作为IVF患者妊娠结局的预测因素。

2 自身抗体

2.1 抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，APA）APA是一组针对膜磷脂或磷脂结合血浆蛋白的自身免疫抗体。目前临床常检测的为抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）、狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）和抗β2糖蛋白Ⅰ（β2 glycoproteinⅠ，β2GPⅠ）抗体。在不明原因不孕症和有RIF史的妇女中，8%～9%存在一种以上的APA阳性[13]。APA主要通过3个靶点导致着床失败：内皮细胞、滋养层细胞和植入前胚胎。APA对内皮细胞的作用会导致血栓形成和血管生成减少，从而导致RIF；其对滋养层细胞分化、增殖或侵袭的抑制作用也会表现为种植失败；其对植入前胚胎的直接毒性作用也会导致不明原因RIF。APA还可诱发炎症性免疫反应，如外周血中NK细胞比例和Th1/Th2比例升高，导致反复妊娠丢失和多次种植失败[14]。

2.2 抗甲状腺抗体（antithyroid antibody，ATA）甲状腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）是指血液中存在ATA。ATA通常指的是抗甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）抗体和抗甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）抗体。患有TAI的女性在ART周期和随后的妊娠过程中很容易出现甲状腺功能障碍，从而导致种植失败和妊娠丢失。Kim等[14]研究发现TNF-α/IL-10比值及CD3+/CD4+细胞比值、CD56+NK细胞水平、APA阳性率和其他非特异性抗体阳性率在患有TAI女性中显著高于无TAI女性，表明TAI对生殖的影响主要是由于免疫失调，而不是简单的内分泌失调。但也有部分研究发现，与ATA阴性患者相比，ATA阳性患者在着床率、妊娠率、活产率等方面无差异，IVF-胚胎移植（ET）后流产的风险也不高[15]。因此对于TAI是否会导致RIF仍存在争议。

关于补充左旋甲状腺素（levothyroxin，LT）能否改善存在ATA的这部分RIF患者的妊娠结局，目前观点不一。Rao等[16]基于随机对照试验的荟萃分析证实了补充甲状腺素（LT4）可降低患有TAI接受IVF/ICSI周期患者的流产风险，然而，其并不能提高临床妊娠率、活产率和早产率。一项近期的Meta分析却提示LT的使用可能会改善TAI患者ART的妊娠结局[17]。

2.3 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）传统认为ANA是与细胞核内容物结合的自身抗体，但实际上其在细胞质和细胞器中也存在。通常将ANA分为抗DNA、抗组蛋白、抗非组蛋白、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体5类。ANA常与自身免疫性疾病相关，如系统性红斑狼疮、系统性硬化和干燥综合征等。Ying等[18]发现ANA水平升高会对卵母细胞和胚胎发育产生不利影响，从而推测ANA水平升高与RIF和RSA有关。ANA谱中抗dsDNA的存在被认为与妊娠失败相关[19]。研究还发现，抗scl-70抗体、抗PM-scl抗体也与IVF/ICSI妊娠结局高度相关[20]。抗着丝粒抗体（anti-centromere antibody，ACA）具有胚胎毒性，在小鼠模型中证实胚胎可能是ACA在植入前的直接靶点[21]。以上研究提示为RIF患者检测ANA可能是有必要的，对当前的临床实践有一定的指导意义。但其局限性在于大多数的研究并没有强有力的证据支持，也很少有随机对照试验验证。

针对RIF患者，可选择筛查同种免疫（NK细胞、MΦ、DC、补体、Th1/Th2、Tregs等）及自身免疫型（APA、ATA、ANA等）相关指标。同种免疫指标过高或过低均不利于胚胎的成功植入，自身抗体阳性也是胚胎种植失败的重要因素。

3 治疗

目前对于免疫因素的治疗主要是抗血栓和免疫调节，使用免疫调节剂或免疫抑制剂调节和抑制免疫系统是治疗RIF的关键途径之一。

3.1 阿司匹林、肝素阿司匹林是非甾体类抗炎药，具有抑制血小板聚集和预防血栓形成的作用。肝素除具有抗血栓作用外，还具有抗炎作用，包括防止白细胞黏附于内皮细胞，其可结合选择素和整合素并干扰补体激活。阿司匹林、低分子肝素早已被用于RSA和RIF的患者。荟萃分析表明在分别使用低分子肝素和安慰剂的RIF患者中，干预组的活产率显著增加（29% vs.16%），而植入率无显著改善[22]；低剂量阿司匹林（50 mg/d）抗凝治疗可使APA阳性患者的活产率由19.1%提升至37.0%[23]；肝素和阿司匹林联合应用于APA阳性的RSA妇女活产率为80%，而单用阿司匹林的妇女活产率为44%[13]。罗希等[24]认为FET前对高D-二聚体的患者行早期抗凝干预治疗（低分子肝素或阿司匹林）可能改善患者的妊娠结局。

3.2 糖皮质激素糖皮质激素由于其强大的广谱抗炎和免疫抑制特性，一直是抑制促炎介质表达和活性的首选药物，并被用作许多免疫调节方案的关键组成部分，是世界范围内对RIF患者的主要治疗方法。Lédée等[25]认为只有子宫内膜Th1/Th2不平衡的RIF患者才能从强的松中获益，而这类人群不到RIF患者的一半。Zhang等[26]首次报道了宫腔内灌注地塞米松对种植窗期uNK细胞增加的RIF患者是有益的，其潜在机制是通过下调uNK细胞的比例，从而提高子宫内膜的容受性，促进了胚胎着床。

强的松联合阿司匹林作为抗血栓药物治疗可改善前次IVF失败的ANA阳性患者的着床率和生殖结局[27]。然而对接受ART的无自身抗体阳性的妇女，目前尚无明确的证据表明在ART周期中使用糖皮质激素可以显著改善患者的临床结局。

3.3 羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）HCQ是一种抗疟药，已广泛应用于各种自身免疫性疾病。其具有免疫调节、血管保护和抗血栓形成等作用，在免疫调节方面，HCQ通过抑制一些Toll样受体的激活而影响固有免疫。HCQ能降低IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平，此外，HCQ还能减少补体依赖性抗原抗体反应和增加Tregs数量。另外，HCQ可降低APA血浆水平，干扰内皮细胞活化和TNF-α的产生，这两个是抗磷脂抗体综合征（antiphospholipid antibody syndrome，APS）的主要作用途径[28]。现已证实在妊娠期使用HCQ是安全的，HCQ可能与先天性缺陷、自然流产、胎儿死亡、早产或活产数量减少的风险增加无关。长期使用HCQ有视力损害性色素性视网膜病变的风险，但Klinger等[29]对21名妊娠期平均每日服用317 mg HCQ、平均暴露时间为7.2个月的孕妇所生的儿童进行了眼科检查，所有儿童均未发现眼部异常，因此在妊娠期间使用HCQ治疗可能不会对后代造成明显的眼部毒性风险。种植窗期高TNF-α/IL-10比值的RIF妇女采用HCQ治疗该比值可以降低，HCQ能够调节具有高Th1/Th2比值的RIF妇女的免疫系统[9]。

3.4 环孢素A（cyclosporine A，CsA）CsA是一种免疫抑制剂，被广泛用来降低移植后排斥反应的风险和治疗自身免疫性疾病。CsA可干扰T淋巴细胞激活和IL-2转录所必需的钙依赖信号通路，通过在细胞质中与亲环素形成特殊的复合物，并与钙调磷酸酶结合形成复合物，该复合物可防止淋巴细胞增殖和淋巴因子转录，从而导致免疫抑制。Azizi等[30]对反复妊娠失败妇女使用CsA治疗后，Th1细胞比例显著降低，Th2细胞比例明显升高，Th1/Th2比值也显著降低，治疗组活产率（81.5%） 显著高于对照组（42.1%）。另外在胚胎植入过程中，趋化因子CXCL12和趋化因子受体CXCR4是必不可少的，在妊娠早期，CsA增加了这些分子的产生，CsA可通过阻断丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信号通路上调趋化因子配体12（CXCL12）/趋化因子受体4（CXCR4）的相互作用，促进滋养层细胞与蜕膜基质细胞的作用，从而增加滋养层细胞的数量和侵袭力[31]。此外，CsA还可调节MMP-9和MMP-2的转录[32]，在妊娠早期，CsA可增加滋养层细胞中MMP-9和MMP-2的蛋白质翻译和蛋白水解酶活性，从而提高了滋养层细胞的侵袭能力。提示CsA可能将是一个良好的治疗策略。

3.5 静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIg）IVIg是由数千健康者的血浆纯化制成的免疫制剂，其含有多种非致病性的天然抗体和自身抗体、抗细菌等外源性抗原的抗体、IgG的Fab片段、CD95等免疫调节肽和各种细胞因子，具有免疫调节和免疫替代的双重作用。目前认为针对RIF患者的最佳剂量为400 mg/kg。IVIg可能是RIF患者一个很好的选择，可引起Th2型反应和细胞因子分泌的改变，降低Th1/Th2比值和NK细胞水平，从而改善妊娠结局[33]。Ahmadi等[34]认为IVIg通过影响Tregs等免疫调节机制，可以提高植入率和妊娠率。其他机制还包括IVIg可以抑制或下调B淋巴细胞产生自身抗体、阻止补体C1q、C3和C4的结合等。

3.6 宫腔灌注

3.6.1 粒细胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）G-CSF可由uNK细胞、黄体细胞合成。G-CSF通过对淋巴细胞、MΦ和Th2细胞的作用，暂时抑制免疫应答，在胚胎着床和妊娠过程中发挥作用。G-CSF在系统性给药时对胚胎发育、着床和滋养层生长均有作用，并且在宫内局部给药时对子宫内膜重塑和容受性有改善作用。因此，补充G-CSF被认为是生殖医学中一种有前途的创新疗法。但最近的一项前瞻性随机对照试验发现对子宫内膜正常的RIF患者进行宫腔灌注G-CSF不能改变子宫内膜厚度、临床妊娠率和活产率[35]。

3.6.2 人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）当着床的第一步开始，囊胚黏附于母体子宫内膜时，胚胎组织就开始积极分泌hCG。在整个妊娠早期，hCG浓度会稳步增加，因为其是由正在形成的胎盘持续释放出来的。越来越多的证据表明，hCG在胚胎植入和胎盘形成中具有重要作用。hCG不仅参与调节早期妊娠事件，还支持母体免疫细胞在建立适当的胚胎-子宫内膜关系中发挥辅助作用。hCG参与上调Foxp3+Tregs，在ET前将hCG注入宫腔，可以通过增加Tregs来改善RIF患者的胚胎植入[36]。

目前关于宫腔灌注hCG的疗效存在争议。Xie等[37]认为宫腔灌注hCG可有效提高2次或2次以上植入失败妇女的临床妊娠率和活产率。而Volovsky等[38]证实了宫腔灌注hCG对临床妊娠率和活产率有负面影响，尤其是对于没有明确RIF的患者。不同Meta分析之间的异质性可能归因宫腔灌注hCG的时间即ET前注射hCG的确切时间点、ET的时间点（卵裂期或囊胚期）、hCG制剂的选择及应用剂量。综上所述，ET前宫腔灌注hCG的总体效果尚不明确，有待进一步研究。

3.7 TNF-α拮抗剂TNF-α拮抗剂阿达木单抗（adalimumab，ADA）可通过其对T细胞的作用直接降低TNF-α/IL-10比值，从而改善RIF的妊娠结局[39]。此外，ADA可能在DC成熟过程中诱导耐受性表型并增强随后对Tregs的诱导。患有自身免疫性疾病的妇女使用ADA并不会增加新生儿的畸形率。

母胎界面免疫失衡及自身抗体的存在可能导致植入失败。因此，使用免疫抑制剂或免疫调节剂有助于预防免疫攻击。最初，免疫调节治疗重点放在抗血栓和糖皮质激素上，然后IVIg因其各种作用机制被引入。如今，新的治疗策略正逐渐形成，例如单克隆抗体和宫腔灌注G-CSF等。最近，用于预防移植排斥的他克莫司和CsA也被用作免疫抑制因子来调节对胎儿的免疫反应。尽管已经有大量文献表明免疫耐受异常及自身免疫抗体在RIF中的作用，但仍需要进一步的研究来阐明免疫调节策略的有效性和安全性。

4 结语

在过去的几年中，生殖免疫学在RIF的研究中甚至发挥了主导作用，母胎免疫耐受失衡及自身抗体的存在可以解释相当一部分不明原因RIF。但对于RIF的免疫研究是否有用以及免疫治疗是否有益，目前还尚无共识。在现有研究的基础上，免疫治疗应用于常规临床实践改善生殖结局仍有争议，不推荐将免疫调节治疗作为常规的治疗。但对于不明原因RIF，推荐进行免疫学相关筛查，选择合适的人群进行免疫调节治疗，以改善RIF的结局。未来迫切需要进行更好的随机对照试验深入RIF人群相关免疫因素的研究。