叶酸载体基因多态性与胎儿神经管缺陷

裴娇娇，谢江燕，伍小莉

神经管缺陷（neural tube defect，NTD）是目前最常见和严重的先天性出生缺陷之一，全世界范围内每年大约有30万例NTD婴儿出生。因此，NTD在世界范围内被认为是给社会和家庭带来巨大经济负担的主要临床问题之一[1]。在我国，NTD的发生率为0.08%[2]，明显低于全球的平均水平（0.186%）[3]，这得益于目前我国全面实施孕妇叶酸干预政策。患有严重NTD的胎儿通常不能存活到足月（如无脑儿），大约9%～10%幸存下来的NTD患儿在儿童期间死亡[4]，极少数轻症NTD患者也很可能患有严重的残疾[5]。NTD以散发病例为主，其病因复杂，包括饮食、环境和遗传等[3-4，6]。众所周知，孕妇补充叶酸可以显著降低NTD患儿的出生风险，然而这种保护性效应的确切机制尚不完全清楚。叶酸在多种细胞代谢途径中发挥至关重要的作用，包括核苷酸和神经递质的产生，组蛋白甲基化调节基因表达，以及将同型半胱氨酸甲基化成为蛋氨酸。妊娠期间，由于胎儿细胞的快速分裂和增殖，对叶酸的需求量也会显著增加。而影响胎儿叶酸浓度的关键是母亲血液叶酸浓度和叶酸胎盘转运能力[7]。目前，胎盘叶酸转运体包括质子耦联叶酸转运蛋白（proton-coupled folate transporter，PCFT）、还原型叶酸载体（reduced folate carrier，RFC）和叶酸受体（folate receptors，FOLR），它们将叶酸转运到胎盘细胞和发育中的胚胎细胞中用于细胞代谢[8]。长期以来，叶酸介导的酶基因被认为是研究人类NTD遗传病因的主要候选基因，而调节叶酸吸收和将叶酸转变成细胞内代谢产物的叶酸载体基因却并未得到研究者的广泛关注。叶酸载体基因主要通过调节叶酸的吸收代谢从而影响人体叶酸浓度。现对叶酸载体（包括叶酸转运蛋白及FOLR）基因多态性与NTD发病的潜在关系进行综述，以探讨叶酸缺乏和NTD发病的分子机制。

1 叶酸转运蛋白

1.1 SLC46A1被称为质子耦联叶酸转运体或PCFT，是一种肠道高亲和力的叶酸转运蛋白，负责将叶酸从肠道转移到血液循环中，编码该蛋白的基因位于染色体17q11.2[9]。该蛋白分子质量为50 ku，有12个跨膜片段，氨基末端位于细胞内，羧基末端指向细胞质[10]，定位于十二指肠黏膜上皮细胞的刷状缘，该部位pH值为5.5，SLC46A1在该部位对叶酸和N5-甲基四氢叶酸均有很高的亲和力，是叶酸的主要吸收部位[11]。此外，SLC46A1基因转录的mRNA在肾脏、肝脏、胎盘、小肠和脾脏中也有表达。该基因功能丧失可导致遗传性叶酸吸收不良（hereditary folate malabsorption，HFM）。HFM是一种以严重的全身和大脑叶酸缺乏为特征的常染色体隐性遗传性疾病，患者即使在叶酸浓度正常的情况下，其脑脊液叶酸水平仍然很低，这会对婴幼儿的髓鞘形成和大脑发育产生巨大影响[9]。

VanderMeer等[12]对爱尔兰NTD患者（549例）、NTD患者母亲（532例）、NTD患者父亲（481例）和无NTD妊娠史孕妇（999例）进行SLC46A1基因检测，并通过基于家庭的关联性检验来评估所选的8个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与发生NTD风险的关系，结果显示，患者携带SLC461A rs17719944小c等位基因与NTD风险增加有关（OR=1.29，95%CI：1.00~1.67，P=0.00），该SNP在显性模型下也表现出关联性（OR=1.3，95%CI：1.05～1.84，P=0.02）。使用乘法模型进行Logistic回归分析发现，母亲携带SLC46A1 rs4795436小g等位基因与降低NTD妊娠风险存在关联（OR=0.62，95%CI：0.39~0.99，P=0.04）。但Zhao等[9]认为妊娠期胎儿叶酸吸收为肠外吸收途径，SLC46A1没有参与该过程，故不会导致胎儿NTD发生。但该研究并未考虑母体SLC46A1突变导致的叶酸吸收障碍以及胎盘SLC46A1对胎儿发育过程中叶酸供应的影响。目前还需要更多高质量的基础研究来确定母体和胎盘SLC46A1在人类胚胎叶酸需求方面的作用，并观察该基因的常见变异是否会影响其功能。

1.2 SLC19A1被称为还原叶酸载体或RFC1，定位于21q22.2～q22.3，包含7个外显子和6个内含子，跨度为15 300个碱基。其编码2个交替剪接的mRNA，一个包含所有7个外显子，另一个不包含第2外显子，但包含其余6个外显子。该基因的转录起点已定位到ATG起始密码子上游约200个碱基对的6个位点。启动子区域没有TATA盒序列，但包含1个共有的Sp1结合位点[13]。SLC19A1基因编码一种完整的膜蛋白，这种膜蛋白是一种双向阴离子交换器，负责对5-甲基四氢叶酸和硫胺素的双向转运，是5-甲基四氢叶酸的重要转运蛋白，介导叶酸进入多种细胞，并维持细胞内叶酸浓度[14]。同时SLC19A1蛋白也是胚胎发育过程中通过胎盘转运叶酸的重要载体[15]。SLC19A1具有多个SNP，其中有3个SNP位点（-43T>C，80G>A和696C>T）处于完全连锁不平衡。SLC19A1-43T>C是转录起始点上游5′侧翼序列中的一个SNP，与SLC19A1表达水平和红细胞中叶酸水平低有关[16]。SLC19A1 696C>T是SLC19A1编码序列中的另一个多态性，但同义突变并不改变氨基酸组成[17]。SLC19A1 80G>A是G等位基因编码的组氨酸转变成了精氨酸。这种转变损害叶酸从母体血液到胎儿的转运，这可能是NTD的母体危险因素[17]。Cai等[18]关于SLC19A1 80G>A多态性与NTD的研究发现，母体SLC19A1 80G>A多态性是子代NTD的危险因素。Cao等[19]对中国北方的152例NTD儿童患者和169例健康儿童的病例对照研究发现，2组人群的SLC19A1等位基因和基因型频率差异有统计学意义（P分别为0.013和0.034），并证实儿童携带G等位基因患NTD的风险更高（OR=1.492，95%CI：1.089~2.044），尤其是G-G-G-T单倍型儿童发生NTD风险明显增加。De Marco等[20]在意大利的一项研究发现，NTD患儿及其父母G等位基因的频率增加。Donnan等[21]对脊柱裂病例进行荟萃分析发现，SLC19A1 A80G等位基因纯合型的母亲其子代患有隐性脊柱裂的风险增加（OR=2.55，95%CI：1.07~6.09）。在以后的研究中，需要更大样本量的临床研究进一步探讨SLC19A1的基因多态性以及该基因与环境的相互作用与NTD易感性的关系。

1.3 SLC25A32SLC25A32基因编码线粒体叶酸转运蛋白（mitochondrial folic acid transporter，MFT）。MFT定位于线粒体内膜[22]，将四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）从细胞质转运到线粒体内。THF在线粒体内通过叶酸一碳代谢途径产生甲酸，甲酸再从线粒体转运到细胞质，为核苷酸生物合成和甲基化反应提供必要的一碳单位[6，23-24]。在细胞质叶酸一碳代谢途径中，至少75%的一碳单位来自于线粒体[22]，补充甲酸盐可以预防78%因SLC25A32基因突变导致的神经管闭合障碍，而补充5-甲基四氢叶酸来预防该类疾病是无效的[24]。

目前关于SLC25A32基因在胚胎发育过程中的作用研究很少。Gao等[25]从美国国家生物信息中心基因表达（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库下载并收集GSE51285的微阵列数据，分析叶酸与NTD的相关性，结果发现SLC25A32与NTD相关。Kim等[24]建立了一个缺乏功能性Slc25a32基因的小鼠模型，以研究该基因在早期胚胎发育过程中NTD发生的作用机制，结果显示，Slc25a32基因的缺失对胚胎的影响是致死性的，并导致所有发育中的小鼠胚胎整个头部区域神经管闭合（neural tube closed，NTC）障碍，从而推测Slc25a32缺失可导致小鼠NTC障碍。很遗憾的是，该研究并没有检测Slc25a32gt/gt小鼠胚胎的线粒体代谢谱和THF的含量。但补充甲酸盐可部分改变Slc25a32gt/gt小鼠胚胎的NTD表型，间接表明线粒体中的THF减少[24]。同时Kim等[24]在美国和中国共收集了1 009个NTD患者的DNA样本，并对其进行重新测序，发现样本中存在SLC25A32编码区双等位基因功能缺失变体。未来甲酸盐很有可能成为临床医师针对叶酸耐药性NTD患者母亲再次妊娠时的治疗选择，应用前提是早期诊断妊娠胚胎SLC25A32基因缺失。虽然四氢叶酸被认为是MFT转运的叶酸形式，但目前还没有直接证据证明这一过程的特异性。因此，对SLC25A32基因突变的研究也将有助于证实MFT特异性转运功能。

1.4 FOLH1也叫谷氨酸羧肽酶Ⅱ（glutamate carboxypeptidaseⅡ，GCPⅡ）。该酶主要通过分解膳食中的聚谷氨酰叶酸，从而调节叶酸的吸收。FOLH1的突变基因可能通过影响GCPⅡ蛋白质表面的空间结构和电荷影响其与配体的结合能力，导致肠道对膳食叶酸的吸收能力降低[26]。

Vieira等[27]对NTD患者及其直系亲属的DNA进行FOLH1基因多态性分析，证实FOLH1 His475Tyr多态性与血浆叶酸水平升高和同型半胱氨酸浓度降低之间存在关联，且NTD患者母亲的FOLH1 His475Tyr突变等位基因频率较高。该研究还发现了1个新的突变，其位于His475Tyr突变体下游的77个核苷酸，但是该重复序列是否改变了剪接功能或基因表达，以及能否通过单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技术来识别该重复序列，从而检测His475Tyr突变还需要进一步研究。Guo等[26]对NTD患者母亲FOLH1基因多态性检测发现，FOLH1基因rs202677多态性是多发性NTD（即存在2个及2个以上的神经管起始部位闭合缺陷[28]）的潜在危险因素，隐性纯合子的孕妇更容易生育多发性NTD患儿，且NTD的严重程度很可能也与母亲FOLH1基因rs202677多态性有关[26]。FOLH1基因rs202676 A>G是无脑儿的潜在危险因素，该基因突变可能通过影响神经管谷氨酸的释放和叶酸的吸收而干扰神经管的发育，导致NTD的发生[26]。FOLH1突变基因是导致NTD发生的遗传易感基因[26]。Xie等[29]对134例NTD患者和156例正常对照者进行rs202676多态性检测，并对检测结果根据不同基因型进行亚组分析，结果发现FOLH1 rs202676 A>G是无脑畸形的潜在危险因素。然而，Paul等[30]对62例NTD患者母亲和73例健康婴儿母亲的血样进行FOLH1基因SNP检测分析，发现FOLH1基因多态性rs202676是NTD发病的保护因素（OR=0.11，95%CI：0.01～0.86，P=0.006 6）。分析原因可能是受环境、种族、饮食习惯等混杂因素的影响，未来期待更多高质量的循证医学证据来验证FOLH1基因多态性与NTD的关系，也期待更多关于FOLH1基因多态性与特定类型的NTD的相关性研究。

2 FOLR

FOLR基因位于染色体11q13.3～q13.5[31]。人类FOLR基因分为FOLR1、FOLR2和FOLR3这3种类型，其中FOLR1和FOLR2编码糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白，对叶酸具有高亲和力，并通过内吞作用转运叶酸，而FOLR3缺乏GPI信号，是FOLR的分泌形式[9，32]。目前，FOLR1与NTD的相关性已得到证实，而FOLR2、FOLR3与NTD的关系尚未明确[33]。研究表明，脉络丛中的FOLR1通过从脉络丛上皮细胞释放含有FOLR1的外泌体，介导5-甲基四氢叶酸从血液到脑脊液的跨细胞转运。FOLR1的表达主要定位于神经褶的最背部（颈部神经褶也已检测到），并随着神经管闭合而上调和延长[33]。FOLR1功能突变会导致脑脊液中叶酸浓度降低，脑叶酸缺乏，从而导致NTD发生。

Saitsu[33]对小鼠Folr1和Folr2基因进行研究发现，基因型为Folr1-/-的小鼠胚胎表现出严重的神经系统形态异常，并在胚胎第10天死亡，但如果怀孕前2周和整个怀孕期间每天补充高剂量叶酸（25 mg/kg），可显著降低Folr1-/-小鼠胚胎中的NTD发生率，而基因型为Folr2-/-小鼠胚胎神经系统发育正常。Saitsu[33]对发育中的胚胎小鼠进行Folr1基因的时间和空间表达特异性分析，发现Folr1与前神经管闭合密切相关。通过lacZ作为报告载体基因进行瞬时转染分析发现，有1个1.1 kb在人与小鼠之间高度保守的增强子序列，推理出人FOLR1基因与人的前神经管闭合有关。Seelan等[32]在研究母鼠Folr1基因型与胚胎发育的影响中发现，基因型为Folr1-/-母鼠的妊娠胚胎细胞增殖、凋亡和迁移均受到显著影响，尤其在叶酸缺乏条件下生长的脑神经嵴细胞和神经管外植体表现出明显的定向迁移减少。Martin等[34]在对叶酸缺乏导致NTD的机制研究中发现，在神经上皮细胞中，FOLR1介导了叶酸的摄取，并触发肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）的激活和磷酸化，促进顶端收缩和胚胎神经上皮的形态发生改变，从而预防NTD。

3 结语与展望

到目前为止，研究人员仍在不懈努力，试图找到叶酸降低NTD发生的机制，并开发新的治疗策略来预防复杂性叶酸耐药型NTD的发生。在敲除叶酸载体蛋白基因的动物模型中，即使不给予缺乏叶酸的饮食干预措施，NTD仍是常见的发育结果[24]。叶酸载体基因多态性的相关研究结果将为有NTD病史或NTD家族史母亲的再次妊娠提供新的临床决策，并将为新的诊断标志物的开发提供希望。

近年来，关于叶酸载体基因多态性对NTD的潜在影响已进行了大量研究，但大部分集中在动物实验中，缺乏高质量的临床对照研究。由于研究的样本量较少，导致风险评估不准确，需要大样本多中心的临床研究来验证结论的可靠性；另外，对不同种群的研究得出了相互矛盾的结论，说明在叶酸载体基因多态性上存在种族连锁不平衡可能；多个协同作用基因之间的相互影响、相互作用对于全面研究它们在NTD发生发展中的作用具有重要意义，这些问题也是目前研究的难点[35]。另外，叶酸载体基因多态性与特定类型NTD之间的联系尚未明确，目前仅观察到叶酸载体蛋白均存在时间、空间特异性，在不同时间和组织中其分布量和活性均不同。在未来的研究中，研究者们可以通过组织特异性与基因多态性及特定类型NTD进行相关性分层分析，进一步寻找NTD的发病机制。