焦磷酸测序检测NUDT15基因多态性的方法学评价

张婕妤，初亚男，封利颖，邹秉杰（东部战区总医院临床药学科，南京 210002）

巯嘌呤类药物广泛应用于自身免疫性疾病，在炎症性肠病和儿童急性淋巴细胞白血病等的治疗中发挥重要作用[1-2]，但会引起致命的白细胞减少症进而导致治疗中断[3]。巯嘌呤甲基转移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）是巯嘌呤类药物代谢过程中的一种酶，其基因多态性与白细胞减少息息相关[4]。2005年美国FDA 推荐服药前行TPMT分型检测以降低不良发应的发生[5]，但亚洲人TPMT突变频率虽远低于欧洲人，白细胞减少的发生率却比欧洲人高，因此可能存在其他因素[6-7]。韩国学者首次发现NUDT15（nucleoside diphophate-linked moiety X-type motif 15，核苷二磷酸连接的部分X 型基序15）R139C 基因多态性（rs116855232）与白细胞减少密切相关，灵敏度和特异性高达89.4%和93.2%，灵敏度远高于TPMT的12.1%[8]。随后中国和日本等亚洲国家的大量学者证实了NUDT15多态性对巯嘌呤类药物引起的白细胞减少的预测意义[9-10]。《中国炎症性肠病治疗药物检测专家共识意见》建议在有条件的情况下，使用巯唑嘌呤类药物前可进行NUDT15基因多态性检测[11]。临床检验中心要求检验项目在引入临床常规实践前应进行方法学性能评价，基因多态性检测的方法层出不穷，焦磷酸测序是一种准确性高的方法，但尚无焦磷酸测序检测NUDT15基因多态性的方法学评价。本文旨在建立焦磷酸测序检测NUDT15R139C 基因多态性的方法并进行评价，为临床合理使用巯嘌呤类药物提供技术指导。

1 材料

1.1 一般资料

随机挑选在本院进行药物基因组学检测人群的EDTA-K2抗凝静脉全血中提取的基因组DNA（浓度≥20 ng·µL－1，A260/A280在1.8～2.0），伦理批件号：2018NZGKJ-067。

1.2 仪器

A200 基因扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；Q24 焦磷酸测序仪（德国QIAGEN 公司）。

1.3 试药

TakaRa Taq扩增试剂盒（日本Takara 公司）；焦磷酸测序试剂盒（德国QIAGEN 公司）；Streptavidin SepharoseTMHigh Performance（美 国GE Healthcare Life Sciences 公司）；水为蒸馏水。所有引物由上海Invitrogen 公司合成。

2 方法

2.1 PCR 扩增

PCR 反应体系体积为50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol·L－1dNTPs 3 μL，25 mmol·L－1MgCl24 μL，Taq 酶0.25 μL，10 μmol·L－1上下游引物各2 μL，蒸馏水32.75 μL，基因组DNA 1 μL。PCR 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃/57℃/60℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增35 个循环；72℃ 10 min。

2.2 焦磷酸测序

取20 μL PCR 产物与2 μL Sepharose、40 μL binding buffer 和18 μL 蒸馏水混合，振荡孵育8 min，将其制备成单链放在24 孔板中，孔板提前加1 μL 10 μmol·L－1的测序引物和24 μL annealing buffer，85℃解链1 min，降温至室温，放入焦磷酸测序仪中。核苷酸序列推注顺序为“CCTTGT”，其中第一个“C”为野生型信号峰，第二个“C”为CMP 的测序本底，第一个“T”为突变型信号峰，第二个“T”为TMP 的测序本底。根据仪器分析结果或者荧光信号峰的比例判断型别。

2.3 数据的统计学处理

使用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，两独立样本比较采用双样本独立t检验；Hardy-Weinberg平衡检验采用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 方法建立

从PubMed 数据库中的SNP 栏中找到NUDT15R139C 的人源基因组序列，利用PyroMark Assay Design 软件设计出评分最高的两组引物序列。具体引物序列见表1，共用一条测序引物。挑选一例杂合型基因组DNA 样本，分别在55℃、57℃和60℃条件下退火，重复检测7 次。比较不同退火温度条件下的荧光信号值，发现第一套引物在57℃时信号最高，因此选用第一套引物和57℃退火温度为NUDT15分型的焦磷酸测序最佳条件（见表2）。

表1 检测NUDT15 R139C 基因多态性的引物序列Tab 1 Sequence of primers used for genotyping NUDT15 R139C polymorphism

表2 不同条件下焦测序荧光信号值(±s)Tab 2 Fluorescence signals detected by pyrosequencing under different conditions (±s)

表2 不同条件下焦测序荧光信号值(±s)Tab 2 Fluorescence signals detected by pyrosequencing under different conditions (±s)

来源 退火温度/℃ 荧光信号值 P 值第一套 55 190±10 0.001 57 213±7 －60 197±22 0.114第二套 55 111±8 ＜0.001 57 116±14 ＜0.001 60 113±6 ＜0.001

3.2 灵敏度评价

将NUDT15杂合型DNA 样本按梯度分别稀释到10、2 和0.4 ng·μL－1，每管加1 μL 模板，空白管加DNA 溶解液，最低能检测0.4 ng 基因组DNA（见图1）。

图1 不同量NUDT15 杂合型基因组DNA 的检测结果Fig 1 Detection of different amounts of NUDT15 heterozygote genomic DNA

3.3 准确度评价

由于未检出NUDT15纯突变TT 型，因此随机挑选经焦磷酸测序验证的CC 野生型11 例和CT 杂合型9 例，将扩增产物送至华大基因公司Sanger 测序，比较两种测序方法的结果（见表3）。两种测序结果符合率100%，焦磷酸测序方法的准确度为100%。将Sanger 测序得到的序列信息经PubMed blast 序列比对后，确定为人源NUDT15基因序列。

表3 焦测序和Sanger 测序检测NUDT15 基因型的结果比较Tab 3 NUDT15 genotype detected by pyrosequencing and Sanger sequencing

3.4 重复性评价

选取两种分型的基因组DNA 样本各1 例，在不同时间点重复检测3 次，检测结果完全一致，重复性符合要求。

3.5 临床样本检测

按“3.1”项下最优条件对临床45 例样本进行NUDT15分型检测，共检出CC野生型33 例（73.3%），CT 杂合型12 例（26.7%），未检出纯突变型样本，符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。

4 讨论

硫唑嘌呤及其衍生物6-巯基嘌呤等嘌呤类药物作为免疫抑制剂被广泛用于炎症性肠病、儿童急性淋巴细胞白血病等治疗中，但其致命性的骨髓抑制不良反应限制了其使用[3]。从疗效和不良反应来看，嘌呤类药物的个体间差异大，使患者服用此药的受益最大化和不良反应最小化十分必要[12]。服药前的药物基因组学检测可优化药物选择和剂量并降低不良反应[13]。目前检测基因多态性的方法有等位基因特异性PCR（AS-PCR）、单链构象多态性（SSCP）技术、焦磷酸测序、基于荧光探针的实时PCR 法等，其中AS-PCR 和实时PCR 需要特别设计引物和探针，反应条件很难优化，SSCP 技术受电泳温度、胶浓度等影响容易造成漏检，焦磷酸测序作为一种准确性高的方法，边合成边测序，能实时获得核苷酸序列的信息[14-16]，适合投入临床应用。

江苏省临床检验中心和国家卫计委提出的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》均强调对每个检测系统在引入常规临床实践前应建立性能验证规范[17]。鉴于目前尚无研究报道关于焦磷酸测序检测NUDT15R139C 基因多态性的方法学评价，本研究通过考察引物和退火温度自建焦磷酸测序方法检测NUDT15R139C基因多态性，并以此为例建立了焦磷酸测序检测多态性位点的性能评估方案，经验证灵敏度达0.4 ng 基因组DNA，准确性和重复性均符合要求，能够投入临床使用，为个体化使用嘌呤药物提供临床支持。