柴胡不同极性部位的体外抗氧化活性研究

黄小凤，刘泽干，雷攀，王莉博，王淑惠，杜士明，*（.湖北医药学院药学院，湖北 十堰44000；.湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 44000；3.武当特色中药研究湖北省重点实验室·湖北医药学院，湖北十堰 44000）

自由基是人体内各种生化反应的中间代谢产物，其异常累积使得机体发生氧化损伤，进而引发疾病，如肝癌、肝纤维化、阿尔茨海默症、糖尿病及心血管等疾病[1]，Abenavoli 等[2]在改善非酒精性脂肪肝患者饮食习惯的研究中发现，与正常饮食组相比，抗氧化剂（Bilirel 复合物）的使用能有效改善患者肝脏脂肪堆积水平和肝硬化程度，表明抗氧化治疗与疾病的发展进程密切相关。现代药理研究发现，人参、姜黄、黄芪、铁皮石斛、丹参等[3-7]中药及其提取物均可通过清除自由基、调节氧化应激反应相关的信号通道（Nrf2/HO-1、AMPK/AKT 等）、降低脂质过氧化水平等方式发挥抗氧化应激的作用。

《中国药典》2020年版收载的柴胡（Bupleuri Radix）为伞形科植物柴胡Bupleuri RadixChineseDC.或狭叶柴胡Bupleuri RadixscorzonerifoliumWilld.的干燥根[8]，为常用解表药，具有和解表里、疏肝升阳的功效，临床主要用于感冒发热、寒热往来、肝郁气滞等症状。现代药理研究表明，柴胡具有抗氧化、抗炎保肝、抗菌和抗肿瘤等药理作用[9-10]。任鹏等[11-13]研究以柴胡为君药的方剂（柴胡疏肝散、小柴胡汤、柴胡愈肝汤）的体外自由基清除能力及抗氧化保肝作用时发现，各方剂均显示出较好的自由基清除能力及较强的抗氧化能力，可进一步发挥保肝作用；研究表明，柴胡黄酮类、皂苷类、多糖类及挥发油类为柴胡发挥药理活性的主要物质基础群，可通过清除自由基、提高抗氧化酶活性等途径发挥一定的抗氧化作用，进而发挥疾病预防或治疗作用[14-17]，以上研究均提示中药柴胡具有一定的抗氧化作用。目前，关于柴胡发挥抗氧化作用的物质基础研究未见相关报道，本实验通过测定柴胡5 种极性部位对羟自由基、DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除能力和铁还原能力，评价柴胡的抗氧化作用，明确作用物质基础，为柴胡药材合理开发利用和临床使用提供实验基础和理论依据。

1 材料

1.1 仪器

KWY-102 型电热干燥箱（武汉市武昌实验仪器厂）；LC-12N-50A 型冷冻干燥机（湖南力辰仪器科技有限公司）；FA-2004 型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；TDL-5A 型台式离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TU-1901型紫外分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试药

柴胡饮片购自湖北神农本草中药饮片有限公司，经十堰市太和医院杜士明教授鉴定为伞形科柴胡属植物北柴胡（Bupleuri RadixChineseDC.）的干燥根；维生素C（海口市制药厂有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、过硫酸钾、三氯乙酸（武汉安格思生物科技有限公司）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（中南化工试剂有限公司）；三氯化铁（仙桃市化学试剂二厂）；铁氰化钾（天津市凯通化学试剂有限公司）；硫酸亚铁（天津博迪化工股份有限公司）；过氧化氢（江西草珊瑚消毒用品有限公司）；水杨酸（中国医药公司）；乙醇及其余试剂均为分析纯（武汉市中天化工有限责任公司）。

2 方法

2.1 柴胡不同极性部位的制备

2.1.1 柴胡水部位的制备[18]取柴胡饮片100 g，按料液比1∶8（g/mL）进行回流提取，先加入纯化水500 mL，回流提取1.5 h，过滤，滤渣再加入300 mL 纯化水提取1 h，合并滤液，减压浓缩至100 mL，冷冻干燥浓缩液得柴胡水部位干燥品11.36 g。

2.1.2 柴胡乙醇部位的制备[19]取柴胡饮片100 g，按料液比1∶8（g/mL）进行回流提取，首先加入70%的乙醇500 mL，回流提取1 h，过滤，滤渣再加入70%的乙醇300 mL 提取0.5 h，合并滤液，减压浓缩至140 mL，冷冻干燥浓缩液得柴胡乙醇部位干燥品14.01 g。

2.1.3 柴胡石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的制备[19]按“2.1.2”项下方法制备乙醇提取浓缩液140 mL，依次用等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集萃取液，旋转蒸发除去有机溶剂、低温冷冻干燥后制得柴胡石油醚部位（1.48 g）、乙酸乙酯部位（1.74 g）和正丁醇部位（1.86 g）的干燥品。

2.2 体外抗氧化活性测定

2.2.1 水杨酸法测定羟自由基清除能力[20]取柴胡不同极性部位干燥品适量，以水或甲醇配制成质量浓度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL－1的供试品溶液，以水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL－1的阳性药物维生素C 溶液。分别取各供试品溶液及阳性药物2 mL，依次加入FeSO4试液（9 mmol·L－1）和过氧化氢试液（8.8 mmol·L－1）各2 mL，摇匀后，再加入水杨酸乙醇试液（9 mmol·L－1）2 mL，混匀，置于37 ℃恒温水浴中15 min，即得测定液；取适量测定液，3000 r·min－1离心10 min，取上清液，采用紫外可见光分光度仪于510 nm 处测定吸光度。

供试品溶液吸光度为Ai，以纯化水为空白对照，吸光度为A0，混合试液为本底对照，吸光度为Aj。根据公式（1）计算出不同质量浓度样品溶液对羟自由基的清除率并通过SPSS 统计分析得到半清除率浓度（IC50）。

2.2.2 DPPH 法测定DPPH 自由基清除能力[21]分别取柴胡不同极性部位干燥品适量，以水或甲醇配制成质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL－1的供试品溶液，以水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL－1的维生素C 溶液。分别取各供试品溶液2 mL 于10 mL 试管中，加入DPPH 乙醇溶液（0.1 mmol·L－1）2 mL，摇匀，室温避光30 min，于517 nm 处测定吸光度。

供试品溶液吸光度为Ai，以纯化水作为空白对照组，吸光度为A0，以无水乙醇代替DPPH 乙醇溶液作为本底组，吸光度为Aj。根据公式（2）计算出不同质量浓度样品溶液对DPPH 自由基的清除率并通过SPSS 统计分析得到IC50。

2.2.3 ABTS 法测定ABTS 自由基清除能力[22]取柴胡不同极性部位干燥品适量，以水或甲醇配制成质量浓度为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg·mL－1的供试品溶液，以水配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL－1的维生素C溶液。将ABTS 溶液（7.4 mmol·L－1）和过硫酸钾溶液（2.6 mmol·L－1）等体积混合，室温避光放置12 h 后，得ABTS 母液，母液用纯化水稀释45 倍作为ABTS 自由基工作液。精密量取ABTS 自由基工作液2 mL 及各供试品溶液1 mL，充分摇匀，室温避光30 min 后，于734 nm 处测定吸光度。

供试品溶液吸光度为Ai，以纯化水作为空白对照组，吸光度为A0。根据公式（3）计算出不同质量浓度样品溶液对ABTS 自由基的清除率并通过SPSS 统计分析得到IC50。

2.2.4 普鲁士蓝法测定铁还原能力[23]取柴胡不同极性部位干燥品适量，以水或甲醇配制成质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL－1的供试品溶液，以水配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL－1的维生素C 溶液。分别精密吸取2.5 mL 各供试品溶液于10 mL 试管中，加入磷酸盐缓冲液（pH ＝6.6，0.2 mmol·L－1）及1%铁氰化钾溶液2.5 mL，充分摇匀，于50℃水浴20 min，取出迅速冷却，再分别加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，充分摇匀后，3000 r·min－1离心10 min，分别吸取上清液2.5 mL 加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL 及纯化水1 mL，充分摇匀，室温静置10 min，于700 nm 处测定吸光度。

供试品溶液吸光度为Ai，以纯化水为空白对照组，吸光度为A0。根据公式（4）计算不同浓度样品溶液的铁还原能力并通过SPSS 统计分析得到半数还原能力（A0.5）。

3 结果

3.1 柴胡不同极性部位提取物对羟自由基的清除能力

结果显示柴胡5 种极性部位均具有较好的自由基清除能力，并且存在明显的量效关系。水部位、乙醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位的IC50分别为0.685、0.835、2.130、0.177、0.985 mg·mL－1，清除羟自由基的能力顺序为：乙酸乙酯部位＞水部位＞乙醇部位＞正丁醇部位＞石油醚部位，详见表1和图1。

表1 柴胡各极性部位提取物对羟自由基的清除能力Tab 1 Hydroxy radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

图1 柴胡各极性部位提取物对羟自由基的清除能力Fig 1 Hydroxy radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

3.2 柴胡不同极性部位提取物对DPPH 自由基的清除能力

柴胡不同极性部位均表现出一定的DPPH 自由基清除能力，且与质量浓度成正相关。其中乙酸乙酯部位对DPPH 自由基的清除能力最强，IC50＝0.171 mg·mL－1，当乙酸乙酯部位浓度为0.8 mg·mL－1时，DPPH 自由基清除能力达到90%。水部位、乙醇部位、正丁醇部位、石油醚部位对DPPH 自由基清除效果依次减弱，IC50分别为0.216、0.249、0.354 和0.422 mg·mL－1，结果见表2和图2。

表2 柴胡各极性部位提取物对DPPH 自由基的清除能力Tab 2 DPPH radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

图2 柴胡各极性部位提取物对DPPH 自由基的清除能力Fig 2 DPPH radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

3.3 柴胡不同极性部位提取物对ABTS 自由基的清除能力

结果显示各部位对ABTS 自由基的清除能力随着提取物的质量浓度增大而逐渐增强，但均弱于维生素C。乙酸乙酯部位清除能力最强，其IC50为0.095 mg·mL－1，其次为正丁醇部位，IC50为0.130 mg·mL－1，水部位和乙醇部位对ABTS 自由基的清除能力相近，IC50均为0.156 mg·mL－1，石油醚部位活性最差IC50为0.265 mg·mL－1，结果见表3和图3。

表3 柴胡各极性部位提取物对ABTS 自由基的清除能力Tab 3 ABTS radical scavenging abilities of diferent polar extracts of Bupleurum

图3 柴胡各极性部位提取物对ABTS 自由基的清除能力Fig 3 ABTS radical scavenging abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

3.4 柴胡不同极性部位提取物的铁还原能力

通过普鲁士蓝法检测铁还原能力，结果水部位、乙醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的A0.5分别为1.053、1.079、1.432、0.491、1.415 mg·mL－1，乙酸乙酯部位铁还原能力最强，但弱于维生素C，各部位提取物均显示出一定的量效关系，与质量浓度成正相关。柴胡各部位的铁还原能力大小顺序为：乙酸乙酯部位＞水部位≈乙醇部位＞正丁醇部位＞石油醚部位，结果见表4和图4。

表4 柴胡各极性部位提取物的铁还原能力Tab 4 Iron reduction abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

图4 柴胡各极性部位提取物对铁的还原能力Fig 4 Reduction abilities of different polar extracts of Bupleuri Radix

4 讨论

本实验采用水杨酸法、DPPH 法、ABTS 法和普鲁士蓝法对柴胡5 种极性部位的体外抗氧化能力进行了评价和比较，结果显示各部位提取物均有较好的体外抗氧化能力；同时，研究发现乙酸乙酯部位的羟自由基、DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力，以及铁还原能力均强于其他部位，当质量浓度达到0.2 mg·mL－1时，清除率均在50%以上，其次是柴胡水部位及乙醇部位，正丁醇部位和石油醚部位逐渐减弱，说明柴胡的不同极性提取部位的抗氧化能力存在差异，其原因可能与5 种极性部位中柴胡主要活性成分的种类及其含量不同有关，柴胡中主要活性成分为柴胡皂苷、柴胡黄酮和柴胡多糖，研究表明，大多皂苷类、黄酮类、多糖类成分具有显著的抗氧化活性[24-26]。Chen 等[27]通过香烟烟雾诱导建立小鼠肺损伤模型，实验组给予柴胡皂苷a 干预，结果显示柴胡皂苷a 可通过激活Nrf2 信号通路，促进血红素加氧酶1（HO-1）的表达，降低髓过氧化酶（MPO）及丙二醛（MDA）水平，发挥抗氧化作用，进而阻断或延缓疾病的进展；杜柯等[28]通过体外化学方法测定柴胡多糖的抗氧化活性研究发现，柴胡多糖可有效清除羟自由基；以上研究提示，柴胡5 种极性部位抗氧化能力的不同，可能与柴胡皂苷、柴胡黄酮及柴胡多糖的含量有关。

本实验主要通过体外化学方法考察柴胡5 种不同极性部位的抗氧化能力，其体内抗氧化作用还有待进一步明确，课题组后续将通过提取分离柴胡物质群并进行体内抗氧化研究，进一步探讨柴胡抗氧化作用的物质基础、协同作用及其作用机制。综上所述，本实验通过检测体外抗氧化能力，发现柴胡各极性部位均具有较好的抗氧化能力，但各部位的抗氧化能力存在一定的差异，其中乙酸乙酯部位的抗氧化活性最强，可为深入研究柴胡活性化合物提供依据。