血清标志物对抗病毒下HBV相关肝癌预测及诊断的研究进展

朱倩钰 马红

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第四大癌症致死病因，慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是亚洲人群发生HCC的重要原因。且有数据表明在我国HCC患者中，有86%为HBV感染所致[1]。近年研究发现，抗病毒治疗能够明显降低肝癌的发生率，但仍不能彻底消除发生HCC的风险[2]。目前欧肝指南推荐抗病毒期间至少每6个月监测腹部超声，而亚洲国家指南多推荐血清学标志物+腹部超声联合模式[3-4]，强调了血清学标志物对尚未形成影像学改变的HCC的监测的重要意义。

一、抗乙型肝炎病毒治疗可降低但不能消除肝癌的发生

乙型肝炎抗病毒药物包括核苷酸类似物(Nucleotide analogues,NAs)及干扰素(Interferon,IFN)，其作用为抑制HBV复制, 减轻肝细胞炎性坏死及纤维化, 从而减少肝硬化失代偿、HCC和其他并发症的发生[5]。然而，国外一项系统性回顾研究[6]表明仅有中等质量级别的证据支持处于免疫活动期的慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治疗可减少发生HCC的风险。我国台湾地区也有长期大样本的[7]回顾性研究显示抗病毒治疗组7年HCC累计发生率为7.3%，而对照组为22.7%。这证实了慢性乙型肝炎患者长期接受抗病毒治疗有助于降低肝癌发生风险, 但是无法彻底消除发生HCC的风险。

二、抗病毒治疗下发生肝癌的危险因素及预测模型

(一)抗病毒治疗下发生肝癌的危险因素 既往研究证实年龄、性别、HCC家族史等患者特征与慢性乙型肝炎患者发生HCC相关。而目前随着生活质量的提高，中国人群代谢综合征的发生率日渐增加，有学者[8]研究了代谢综合征对中国大陆慢性乙型肝炎患者肝细胞癌风险的影响，结果表明代谢综合征对肝癌风险增加2倍。中心性肥胖和2型糖尿病与肝细胞癌风险显著增加有关。对于合并脂肪肝的乙型肝炎患者，HCC风险增加的主要原因可能为脂肪肝引起抗病毒药物疗效下降进而影响病毒转阴率。

在乙型肝炎抗病毒治疗过程中，病毒学指标及肝脏炎症指标是两大重点关注指标。在长期随访过程中部分患者HBV DNA始终轻度升高或反复间断异常，或可增加HCC发生风险。国外一项长期回顾性队列研究[9]分析低水平病毒血症(HBV DNA<2 000 IU/mL)对肝细胞癌风险的影响，结果发现低水平病毒血症患者与持续病毒学应答(HBV DNA<12 IU/mL)患者发生肝细胞癌的风险比为1.98(P=0.002)。此外，我国香港的一项回顾性研究[10]发现，当HBV DNA为阴性时(<20 IU/mL)，达到乙型肝炎表面抗原血清学转换可进一步降低患肝癌的风险。近年来，有学者关注乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)在HCC的预测作用[11]，该研究包括76例HBV DNA阴性的肝癌患者和152例对照，以上患者均接受NAs治疗，结果显示当以HBcrAg≥7.8 kU/mL为cutoff值时，HCC发生的AUROC为0.61，可为HBV DNA阴性时HCC的发生提供有效预测。谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)是反应肝脏炎症的最重要指标，ALT复常有利于改善组织学病变进展。ALT的升高倍数和复常时间的长短或可为抗病毒下HCC发生的危险因素。我国香港的一项队列研究[12]纳入21 182例接受NAs治疗的慢性乙型肝炎患者，根据AASLD指南标准评估抗病毒治疗12个月时的ALT情况与远期肝细胞癌风险。结果表明HCC累积发生率在治疗12个月时ALT正常组、ALT(1～2×ULN)组及ALT(≥2×ULN)组呈升高趋势，且三组之间存在统计学差异。

近年研究者们发现，大部分长期规律服用抗病毒药物且定期随访的患者均可达到转氨酶复常及HBV DNA阴性，甚至部分肿瘤标记物正常的患者却仍进展为HCC。故开始有研究关注到肿瘤标记物的逐渐升高趋势(即使在正常范围内)也是HCC发生的危险因素。国外一项研究[13]显示在抗病毒治疗下甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)超过7 ng/ml可以预测1年内HCC的发生。Choi J[14]等研究也发现HCC患者异常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin ，DCP)水平从确诊HCC前半年开始升高，甲胎蛋白异质体(lectin-reactive AFP，AFP-L3)则从确诊前1年开始升高。基于上述危险因素，研究者提出了很多关于HBV患者发生HCC的预测模型。

(二)乙型肝炎肝癌预测模型 在过去十年来，国内外已有多种预测模型。“GAG-HCC”[15]评分包含因素为年龄、性别、HBV DNA、核心启动子突变与肝硬化，HCC 5年预测的AUC值为0.88，10年AUC值为0.89，但因突变这一因素在临床实践中的局限性，目前并不是很实用。为解决这一问题，Wong VW等[16]提出了包含年龄、白蛋白、胆红素、HBV DNA和肝硬化五个因素的CU-HCC模型，该模型5年预测的AUC值为0.76，10年AUC值为0.78。2011年，有研究者等[17]提出包含年龄、性别、ALT、HBeAg状况、HBV DNA水平的“REACH-B”评分，5年AUC值为0.759，有同等预测价值。肝脏弹性测定在临床中普遍应用之后，Wong GL等[18]建立了基于肝脏硬度值(liver stiffness measurement，LSM)的LSM-HCC预测模型，5年AUC值为0.83，预测价值更佳。

在目前抗病毒时代，病毒复制被很好抑制，上述基于HBV DNA的模型可能不再实用，Jung KS等[19]在2015年提出mREACH-B评分模型，将LSM替换HBV DNA，并验证了上述四种模型，结果发现mREACH-B评分模型对HCC预测的AUC值最高。此外，国外一项基于高加索人群[20]的研究建立了PAGE-B评分，该评分系统仅包括年龄、性别及血小板，当PAGE-B评分≥10时，预测前5年HCC发展的敏感度100%，特异度41.2%，阳性预测值9.8%，阴性预测值100%。如今开始有研究关注肿瘤标记物单独或联合其他指标对HCC的预测作用。刘梦晓[21]研究发现，AFP联合LSM、FIB-4指数可显著提高预测慢性乙型病毒性肝炎肝硬化患者发生HCC的诊断效能，AUC值为0.973。但目前关于将肿瘤标志物纳入HCC预测模型的研究并不多，有待进一步探索。

三、血清学标志物在HCC诊断中的应用

HCC的监测主要分为血清学上及影像学上的监测，对于尚未形成影像学改变的HCC患者，其血清学指标的变化往往更能及早的做出预警。目前常用的HCC相关血清标志物包括AFP、AFP-L3、DCP等经典标志物以及新型标志物如微小RNA(miRNA)、热休克蛋白(Heat Shock Proteins，Hsp)等，不同标志物联合检测更有效提高了HCC诊断的准确率。

(一)HCC经典肿瘤标志物 即便欧肝和美肝指南未强烈推荐应用AFP作为HCC筛查，但在以HBV感染为主的亚洲地区，AFP仍是HCC监测中最常用的血清学标志物。我国最新版原发性肝癌诊疗规范中(2019版)[22]仍规定，AFP对肝癌的诊断界值为400 μg/L。但以此作为抗病毒治疗下HCC诊断界值时，其灵敏度不免会偏低。国外一项研究[23]得出，在ETV抗病毒治疗下AFP最佳诊断界值为13 ng/mL，此时敏感度为50.0%，特异度为98.8%，阳性预测值为77.8%，阴性预测值为96.1%。近年有研究将AFP的界值制定的更低(5～12 ng/mL)[14,24-25]，上述研究成果均提示在应用血清AFP诊断HCC时，对于接受抗病毒治疗的患者应适当降低诊断界值。

近年来DCP也是一种常用于肝癌诊断的标志物，目前已应用于临床，由于DCP和AFP产生的途径及机制的不同，因此两者在血清中含量是相对独立的，无相关性，联合检测有助于提高肝癌检出的效能。国外一项研究[26]以DCP cut off值为42 mAU/mL，AFP cut off值为5.5 ng/mL，得出单项检测时DCP的敏感度明显高于AFP(77% vs 61%)，当两项指标联合检测时AUC可达0.826。

AFP-L3由恶性肿瘤细胞产生, 也是公认的预测肝癌的有效指标，与DCP一同可为AFP阴性的HCC患者进行早期诊断。Lim TS[27]等研究表明三者联合检测(cut off值:AFP 20 ng/mL，DCP 40 mAU/mL，AFP-L3 5%)较单一指标可提高早期肝癌和小肝癌的诊断率。Choi J等[14]研究也证明AFP和AFP-L3联合应用(cut off值分别为5 ng/mL和4%)显著提高了早期HCC检测的敏感性。但需指出的一点是，以上对于DCP及AFP-L3的研究所纳入的HCC患者不仅仅是乙型肝炎患者，且未明确是否经治，目前在抗病毒治疗的背景下，三联检对乙型肝炎肝癌预警作用的报道尚不多，需要更多的研究探索。

(二)HCC诊断的新型标志物 miRNA是在动物、植物以及一些病毒中发现的约22个核苷酸的短链非编码RNA分子, 参与基因的转录后调控。目前miRNA在肝癌诊断及预后方面也体现出了潜在价值，也被我国最新版原发性肝癌诊疗规范中所提及。Ning SF等[28]研究表明，miR-155、miR-96、miR-99a可以作为肝癌诊断的生物标志物，三者及三者结合诊断的曲线下面积分别为0.84、0.824、0.799和0.931，且三种miRNAs联合AFP对肝癌的诊断准确率更高(AUC为0.979；敏感性为90.0%；特异性为100.0%)。

热休克蛋白(HSP)是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应激蛋白质，按照蛋白的大小共分为五类，分别为HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白(small Heat Shock Proteins,sHSPs)。有研究[29]发现Hsp70在肝癌组中的表达水平明显高于肝硬化组(P=0.003)，肝癌诊断灵敏度为98.9%,特异度为77.8%，且在低分化组和中分化组的表达水平高于高分化组(P<0.05)，表明Hsp70对肝癌的诊断具有重要的临床和病理意义。Fu等[30]研究也发现Hsp90α诊断AFP阴性肝癌患者的灵敏度为93.9%, 特异度为91.3%；同时对于早期肝癌及小肝癌(≤3 cm)也有一定的诊断能力。由此可见，HSP目前在肝癌的诊断方面也显示出良好的前景。

已研究过的其他HCC血清标志物还有循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)等[31]，联合检测敏感度及特异度高，可用于早期诊断，但目前上述血清标志物尚未推荐用于HCC临床监测，更需进一步探索研究。

(三)HCC诊断模型 2013年有研究者建立了以性别、年龄、AFP、AFP-L3及DCP 5个变量构成的GALAD肝癌诊断模型，且有后续研究证明该模型的诊断效能优于AFP/DCP/AFP-L3三联检或任意单检[32]。近年，有研究[33]验证了此模型在中国患者中的效能，并探索出一套新的更适合中国患者的剔除AFP-L3后的ASAP诊断模型。经分析，ASAP模型的诊断效能优于GALAD评分(P=0.006)。纪冬教授团队[34]研究出基于年龄、LSM和AFP的ALA早期无创预警模型(ALA=0.103×Age+0.116×LSM+0.026×AFP；cut off值：age 51岁，LSM 27 kPa，AFP 38 ng/mL)，建模组ALA的AUROC为0.91，使用ALA分值9.61作为截断值，验模组诊断HCC的准确度为84.3%，有着良好的预警效能，并且简单易行、经济无创、可重复性高。此项研究的研究对象均为乙型肝炎患者，但同样上述模型的建立均未明确是否行抗病毒治疗，或许在抗病毒的基础上，以上变量的界值会有所降低，可进一步研究。

四、总结

抗病毒治疗虽然能够降低肝癌的发生率，但仍不能彻底消除发生HCC的风险。即使在抗病毒下，也仍存在发生HCC的危险因素，故应加强对高危患者进行定期的监测及早诊断。目前,，学者们开始关注血清学标志物对于如今抗病毒环境下HCC发生的预测及诊断的价值。但目前指南仍尚未明确血清标志物在抗病毒治疗下的诊断界值，因此，血清标志物单独或联合检测在抗病毒治疗下对HCC的预测及诊断价值仍有待进一步研究。