HBV pgRNA定量指导安全停用核苷(酸)类似物的研究进展

刘 月 邹志强

慢性乙型肝炎(CHB)及其引起的肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌是严重威胁中国人群健康的疾病[1]。目前国际公认的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物包括(聚乙二醇)干扰素和核苷(酸)类似物(NA)两类，后者因给药方便、有效率高等特点而广泛应用于CHB患者的抗HBV治疗中[2-4]。CHB是由HBV感染引起的，并且有针对病因的治疗，因此理论上CHB患者的抗HBV治疗是有望实现有限疗程的。美国肝脏研究学会(AASLD)、欧洲肝脏研究协会(EASL)、亚太肝脏研究协会(APASL)、中国的CHB防治指南中都明确指出了无肝硬化患者的停药标准，然而在临床实践中，一旦停药，有一部分患者会出现HBV DNA的突破。目前已知共价闭合环状DNA(cccDNA)的完全衰退提示HBV的消除，是一种接近CHB治愈的状态[5]。虽然NA可有效抑制HBV复制，但不能直接作用于cccDNA，很难实现CHB的临床治愈[6-7]。因此，大多数CHB患者需要长期治疗。本文就HBV pgRNA定量用于指导安全停用NA的研究进展作一综述。

1 HBV DNA及HBsAg用于指导NA安全停用的局限性

为了避免HBV DNA反弹，在停止NA治疗前确定肝内cccDNA沉默或消除是必要的。但在临床实践中，由于检测cccDNA需应用侵入性检查，因此定期检测肝内cccDNA水平并不可行[8-9]。既往研究表明，血清HBV DNA和HBsAg水平均与肝内cccDNA活性呈正相关，HBV DNA被广泛用于判断患者病毒学应答、疗效观察及巩固治疗后停药的重要指标[10]。然而，在NA治疗过程中，血清HBV DNA消失可能并不代表肝内cccDNA被清除或处于转录沉默状态[11]。当将持续消失的血清HBV DNA作为NA停药的前提条件时，与经常出现的治疗外HBV DNA反弹和疾病复发不同，对于已达到HBsAg消失的患者，无论有无抗HBs血清转换，复发都是相当罕见的[12]。因此，血清HBsAg的消失已被认定为抗HBV治疗的理想终点[2]。近年来HBsAg定量检测方法已经商业化，并且被广泛用于抗HBV有效性的预测和对HBV感染的初治患者的管理[13]。但有研究显示，HBsAg消失10年后，约14%的患者肝脏中仍可检测出cccDNA[2]。许多因素可能是将血清HBsAg作为经NA长期治疗患者肝内cccDNA转录活动的替代指标的障碍，如HBV DNA整合组，以及NA长期治疗相关的HBsAg滞留等问题。尽管目前抗HBV药物层出不穷，但血清HBsAg消失仍很难实现[13]。如将血清HBsAg持续消失作为功能性治愈或临床治愈的判定标准，可能会使一些患者继续接受不必要的抗病毒治疗[11]。因此，临床上亟需能够提示安全停用NA的指标。

2 血清HBV RNA的存在形式及来源

1990年代初的一些研究显示，HBV感染患者外周血单核细胞中可测得HBV RNA[14-17]，然而直到1996年，Köck等[18]才首次在HBV感染患者的血清中发现血清HBV RNA。Wang等[19]和Jansen等[20]发现HBV感染患者血清中的HBV RNA实质上是核衣壳内未经转录的HBV前基因组RNA(pgRNA)，来自感染肝细胞内cccDNA的转录。这些含有未经转录pgRNA的核衣壳也可获得病毒外膜，并可以病毒样颗粒形式释放。

3 HBV pgRNA与 cccDNA的关系

HBV属嗜肝DNA病毒科(hepadnabitidae)，是一种双链环状DNA。HBV通过将肝细胞膜上的钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)作为受体进入肝细胞[2]。HBV进入肝细胞后，首先脱去外膜，HBV DNA双链形成松弛环状DNA(rcDNA)，rcDNA进入细胞核，在细胞核中转化为cccDNA，cccDNA作为微型染色体持续存在，并且为5种病毒mRNA的转录提供模板，其中3.5 kb的pgRNA也为HBV DNA负链的逆转录提供模板。HBV DNA聚合酶与pgRNA的结合提供了包装信号，随后使用核心蛋白组装病毒衣壳。其后衣壳化的pgRNA经逆转录产生病毒DNA的负链，并且正链DNA不完全由负链DNA合成。新合成的rcDNA被病毒表面蛋白包围，并被释放成Dane颗粒，或者重新进入细胞核以补充cccDNA池[12]。cccDNA半衰期较长，难以从体内彻底清除，对慢性HBV感染起着重要作用[2]，由于cccDNA定量需要侵入性检查，因此探索能反映cccDNA活性的替代检测指标很重要。HBV通过pgRNA逆转录形成cccDNA，pgRNA也可由cccDNA转录生成，与HBsAg不同，HBV pgRNA仅来自于肝内cccDNA，并且其数量不受病毒抗原或抗体复杂性的影响。因此，血清pgRNA水平能反映cccDNA的状态，包括cccDNA的水平及其转录活性[13,20-21]。

4 HBV pgRNA可预测HBeAg血清学转换

长期的病毒抑制表现为HBeAg血清学转换，可诱导一部分患者的病毒免疫抑制[22-23]。有研究表明NA治疗可帮助超过60%的患者在治疗后1年实现HBV DNA不可测得，少数患者能实现血清学应答(HBeAg和HBsAg消失，有或无相应抗体)[24]。即使HBV DNA维持在不可测得水平，也很难预测是否患者有血清学应答。有研究通过比较发生HBeAg血清学转换组与未发生HBeAg血清学转换组的血清HBV RNA水平，发现后者的血清HBV RNA水平升高,同时发现治疗前血清HBV RNA水平低于4.12log10copies/mL的CHB患者更易实现HBeAg血清学转换[25]。另有研究也发现在NA治疗期间，与其他患者相比，HBeAg血清学转换的患者的HBV RNA显著下降[21]。血清HBV pgRNA阳性患者不能实现HBeAg清除的风险更高(HR=6.69，95%CI：1.88～23.84)[26]。上述结果提示血清HBV pgRNA是一个可在NA治疗中预测HBeAg血清学转换的独立指标。

5 HBV pgRNA有潜力作为NA安全停用的预测指标

pgRNA是cccDNA的直接产物，其能反映肝内cccDNA的活性，并且阻断逆转录不影响HBV pgRNA的合成。有研究发现，在NA治疗期间，因NA干扰逆转录，会导致HBV RNA颗粒过度累积在肝细胞中，并且导致没有逆转录颗粒的释放；此外，还发现HBV RNA颗粒的存在与耐药有关，认为血清HBV RNA颗粒的存在可能与HBV复制活动有关，并且有高复制活动的病毒产生大量HBV RNA，更易导致耐药突变株的产生，因此推测血清HBV RNA水平可能与HBV复制活动有关[27]。有研究显示，治疗12周时血清HBV pgRNA是最初病毒学应答的一项新的预测指标，并且是除HBV DNA水平外唯一独立的最初病毒学应答治疗预测指标，同时证明了在治疗中(12周)血清HBV DNA和pgRNA水平可能可以预测HBV的重新激活[28]。另有研究评估了恩替卡韦治疗前后的患者血清HBV RNA，结果显示治疗期间实现病毒学应答的患者的血清HBV RNA水平明显降低，这表明血清HBV pgRNA水平可预测病毒学应答[26]。作为直接反映肝内cccDNA水平的替代指标，血清HBV pgRNA水平是评估抗病毒治疗有效性的指标之一，其也可用于预测停药后的耐药和复发[19-21,27,29]。研究表明，在终止NA治疗的患者中有超过70%出现肝炎重新活动；多种逻辑回归分析显示，NA治疗3个月后血清HBV DNA+RNA水平与HBV DNA反弹有关，还发现NA治疗3个月后，与HBV DNA非反弹组相比，HBV DNA反弹组的血清HBV DNA+RNA水平较高, HBV DNA反弹组在NA治疗期间维持着高HBV复制活动，与HBV RNA基因组相关的非成熟HBV颗粒不断产生并在肝细胞中累积，治疗终止后，这些非成熟HBV颗粒可能成熟并释放，因此血清HBV DNA水平反弹在NA治疗后迅速发生[27]。有研究显示目前可检测到的血清中HBV RNA为pgRNA[19]。上述研究结果表明，血清中HBV pgRNA水平可能与HBV DNA反弹有关。由此推测，如在NA停药前检测血清中的HBV pgRNA水平对患者的复发风险进行预判，将有助于甄别出那些已达到病毒学应答并在停药后能维持病毒学应答的“部分治愈”患者，从而实现安全停药[11]。血清HBV pgRNA水平在停药原则和耐药及病毒复发的预测上具有重要意义。但因不同研究团队采用的检测方法不完全相同，因此目前将血清HBV pgRNA作为安全停用NA的预测指标尚需更多大样本的研究来证明。

6 小结

HBsAg既来自于cccDNA，也来自于整合基因组，HBsAg和HBV DNA不能完整代表cccDNA的转录活动。HBV RNA已知为pgRNA，仅来自cccDNA，可以反映cccDNA活性，结合对HBV pgRNA的全面了解，血清HBV pgRNA可能可以作为CHB患者安全终止NA治疗的指标。今后还需大样本临床研究来证明HBV pgRNA指导NA安全停药的可行性。