胃癌患者血清miR-515-3p水平与临床病理特征及预后的关系

吴维宇 汪 力 张雪莲 黎 军

原发性胃癌是中国消化道常见肿瘤，由于人口老龄化等原因，原发性胃癌的发病率呈逐年升高趋势，对符合适应证的患者及时行手术治疗是延长生存时间的有效方式[1-2]。随着原发性胃癌患者手术治疗的增加，有研究发现病情相似患者的远期生存结局存在较大差异[3-4]，推测存在某些影响预后的重要因素。Han等[5]的研究显示miR-515-3p可能是参与胃癌发生的潜在生物学标志物。本研究探讨了血清miR-515-3p与原发性胃癌患者病情及手术后生存结局的内在联系，旨在为原发性胃癌患者的预后预测、治疗方案个体化等提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月至2015年1月在成都医学院第一附属医院接受胃癌手术治疗的130例原发性胃癌患者作为原发性胃癌组，其中男性67例、女性63例，年龄41～78岁，平均年龄为(56.84±9.17)岁，术前体质量指数(BMI)20～26 kg/m2，平均BMI为(23.03±2.87)kg/m2。纳入标准：(1)手术切除标本经病理检查证实为原发性胃癌，为首次确诊并接受手术治疗；(2)术前未曾接受新辅助化学治疗；(3)能遵照医嘱接受系统治疗、临床资料完整；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他原发性恶性肿瘤；(2)妊娠或哺乳期女性；(3)合并严重传染性疾病、乙醇和药物滥用、精神病史等可能影响治疗过程及治疗结局的其他疾病。病例脱落标准：(1)未按照预定方案完成治疗；(2)拒绝随访或随访期间失联；(3)随访期间因其他原因导致死亡。130例患者均完成随访。另选择同期在本院进行体检的100名健康志愿者作为正常对照组，其中男性51例，女性49例，年龄39～77岁，平均年龄为(56.17±10.85)岁，BMI 21～26，平均BMI为(23.18±2.39)kg/m2。原发性胃癌组与正常对照组的性别、年龄、BMI等基础资料差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 血清miR-515-3p水平测定

原发性胃癌组和正常对照组均于入组时即抽取空腹外周静脉血5 mL，2 000 r/min离心10 min，留取上层血清标本，冻存于-80 ℃冰箱中备用。miR-515-3p水平的具体测定步骤是：加入TRIzol提取总RNA，采用Bio-Rad680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)测定其浓度和纯度，使用反转录试剂盒(日本TOYOBO公司)将总RNA反转录为cDNA。以U6作为内参进行标准化定量，引物序列见表1。使用定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒进行基因扩增，反应条件是95 ℃ 10 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共42个循环。每个样品设3个复孔，以2-△△Ct计算miR-515-3p基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 临床病理特征评价

纳入性别、年龄、肿瘤最大直径、Lauren′s分型、TNM分期、分化程度、局部浸润深度、淋巴结转移这8项临床病理特征进行比较。

1.4 随访及终点事件明确

对于原发性胃癌组患者，术后采用电话、门诊复诊等形式进行长期随访，以2020年1月1日或该时间点前患者死亡作为随访终点。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料的两组间比较采用独立样本t检验，计数资料的两组间比较采用卡方检验，不同血清miR-515-3p水平胃癌患者的预后比较采用Kaplan-Meier生存曲线，血清miR-515-3p水平对胃癌患者预后的预测价值分析采用受试者工作特征(ROC)曲线，原发性胃癌患者预后的影响因素采用Cox比例风险模型分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组的血清miR-515-3p水平比较

原发性胃癌组和正常对照组的血清miR-515-3p水平分别为0.66±0.11、0.46±0.09，前者显著高于后者，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 原发性胃癌患者血清miR-515-3p水平与临床病理特征的关系

不同性别、年龄、肿瘤最大直径、Lauren′s分型的原发性胃癌患者的血清miR-515-3p水平的差异无统计学意义(P>0.05)。不同TNM分期、分化程度、局部浸润深度、淋巴结转移的原发性胃癌患者的血清miR-515-3p水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 原发性胃癌患者血清miR-515-3p水平与临床病理特征的关系

2.3 血清miR-515-3p水平预测原发性胃癌患者预后的ROC曲线

截至随访终点，130例原发性胃癌患者共有56例(43.08%)死亡。经ROC曲线发现，血清miR-515-3p水平预测原发性胃癌患者随访期内死亡的最佳截断值为0.67，ROC曲线下面积(AUC)为0.790(95%CI：0.714～0.865)，对应的敏感度、特异度分别为71.62%、64.29%。见图1。

图1 血清miR-515-3p水平预测原发性胃癌患者预后的ROC曲线

2.4 不同血清miR-515-3p水平的原发性胃癌患者的预后比较

以根据ROC曲线约登指数计算出的血清miR-515-3p水平(0.67)为界，将130例原发性胃癌患者分为高表达组(79例)和低表达组(51例)。Kaplan-Meier生存曲线显示，miR-515-3p低表达组的预后优于miR-515-3p高表达组(P<0.05)。见图2。

图2 不同血清miR-515-3p水平原发性胃癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.5 原发性胃癌患者预后影响因素的Cox比例风险模型分析

以血清miR-515-3p水平、TNM分期、分化程度、局部浸润深度、淋巴结转移作为自变量进行原发性胃癌预后影响因素的Cox比例风险模型分析，结果显示血清miR-515-3p水平较高、TNM分期较高、分化程度较低、局部浸润深度较大、合并淋巴结转移是原发性胃癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 原发性胃癌患者生存预后影响因素的Cox比例风险模型分析

3 讨论

原发性胃癌的治疗方案主要根据患者的临床病理特征确定，早期实施手术治疗对患者预后改善具有决定性作用。然而，接受相同治疗方案的患者的预后存在差异，若能早期筛查患者的治疗后死亡风险，并对治疗方案进行个体性优化、可能有助于治疗后胃癌患者的生存时间延长、病死率降低等。越来越多的证据表明微RNA(miRNA)异常表达在包括胃癌在内的恶性肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。李伟等[6]的研究发现，胃癌组织中miR-181高表达、miR-133a低表达，两者均可能参与了胃癌的发生、发展，且影响了患者的预后。何春华等[7]的研究发现，胃癌患者的血清miR-93-5p水平升高，且与临床分期、浸润深度、淋巴结转移关系密切，在胃癌诊断和预后预测中具有重要价值。miR-515-3p于2019年首次被发现在原发性胃癌患者的癌细胞及血浆中异常高表达，初步提示其可能参与了胃癌的发生、发展，但其对患者预后的影响尚不明确[5]。国内尚未见miR-515-3p相关的临床研究报道。本研究发现，与正常对照组相比，原发性胃癌组的血清miR-515-3p水平明显升高，与既往研究结论吻合。进一步分析血清miR-515-3p水平与原发性胃癌患者临床病理特征的关系，发现TNM分期较高、分化程度较低、局部浸润深度较大、合并淋巴结转移的患者的血清miR-515-3p水平较高。TNM分期、分化程度、局部浸润深度、淋巴结转移是判断大多数肿瘤恶性程度的重要指标[8-10]，上述结果再次佐证了血清miR-515-3p高表达对原发性胃癌患者病情的促进作用，其具体作用机制不明，有待后续深入研究。

目前原发性胃癌患者的手术治疗预后并不十分理想，部分患者在术后短时间内死亡[11-12]，多数研究认为这是一个多因素作用的结果，但尚缺乏有效手段将高死亡风险患者在术前筛查出来。鉴于血清miR-515-3p水平与原发性胃癌患者病情进展的紧密联系，推测其可能在患者死亡风险筛查中具有一定的价值。本研究采用ROC曲线进行分析，发现血清miR-515-3p水平预测原发性胃癌患者随访期内死亡的最佳截断值为0.67，AUC为0.790(95%CI：0.714～0.865)，对应的敏感度、特异度分别为71.62%、64.29%。上述结果提示血清miR-515-3p水平在术前预测原发性胃癌患者术后远期死亡风险方面具有一定价值，有可能成为TNM分期相同患者的病情进一步分级、治疗方案个体化的重要参考指标。

本研究对原发性胃癌患者进行长期随访并分析死亡结局，发现miR-515-3p低表达组原发性胃癌患者的预后更优。进一步经Cox比例风险模型分析证实，血清miR-515-3p高表达是原发性胃癌患者预后不良的独立危险因素。上述结果证实血清miR-515-3p表达变化对原发性胃癌患者手术后预后不良存在直接影响，其可能成为胃癌治疗的新靶点，这有待更多基础研究及临床实践明确。

综上所述，原发性胃癌患者血清miR-515-3p水平异常升高，且与临床病理特征存在紧密联系，是患者术后远期死亡的独立危险因素之一，且术前血清miR-515-3p表达水平对患者远期死亡风险具有早期预测价值。本研究明确了血清miR-515-3p水平在原发性胃癌患者病情及预后方面扮演的重要角色，但也存在不足之处：(1)纳入病例数有限，可能使结果发生偏倚；(2)未涉及靶向干预miR-515-3p对原发性胃癌病情的影响等。后续将完善不足之处，进行深入研究。