国产谷胱甘肽还原酶试剂盒分析性能验证与评价

况凌云，桂晓美，徐连强

（江西省人民医院检验科，江西 南昌30006）

还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内清除活性氧(ROS)的一种抗氧化物[1],谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)通过氧化GSH为氧化型谷胱甘肽（GSSG）有利于清除过氧化物。而谷胱甘肽还原酶（GR）作为另一种细胞内还原酶,它能还原GSSG成GSH,维持GS H/GSSG的比值[2]，而GSH/GSSG比值被认为是抗氧化能力的灵敏参数[3]。因而，GR在机体清除氧化损伤上起到至关重要的作用。近年来学者对GR的关注逐渐增多，GR检测逐步推广于临床应用。据相关研究报道，GR有利于增强宿主抵抗细菌感染的能力，并且血浆GR的活性与脓毒症休克的预后密切相关[4,5]；在肺损伤、肾移植、肝脏损伤以及慢性乙型病毒肝炎中的患者中，GR的浓度也都有相关性的变化[6-9]。本实验室在日立7600-120全自动生化分析仪上测试GR，为保证结果的可靠性，此研究对目前中拓生物有限公司生产的GR测定试剂盒进行详细的分析性能验证，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2018年10月份在江西省人民医院就诊患者的新鲜血清标本,健康人群组选取本院同一时期体检中心健康人群者20例，男女各占一半，年龄覆盖各年龄层。上述所有标本均无溶血、无黄疸、无脂浊，且2h内无法进行检测的血清标本均于-20℃冻存处理。

1.2 仪器与试剂⑴仪器：仪器为HITACHI 7600-120全自动生化分析仪；⑵试剂：谷胱甘肽还原酶试剂为中拓生物有限公司制造,实验过程中使用原厂配套的校准品和质控品。干扰试验所用干扰物为宁波瑞源生物科技有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 精密度评价 根据美国临床和实验室标准化协会(Clinicaland LaboratoryStandards Institute,CLSI)EP15-A2方案来验证其精密度。配制高、低浓度两个水平的混合血清，分装并-20℃冻存。每天分别重复测试2个水平浓度血清标本4次,连续检测5天,计算批内CV（%）和总CV（%），并确认其不精密度范围是否小于厂商提供的精密度。

1.3.2 正确度试验 根据CLSI EP9-A2方案评价其正确度。该方案包含两种程序来核实其正确度：一是用病人样本进行方法学比对；二是通过检测定值的参考物来计算回收率。由于本区域缺乏其他对照方法,故需通过检测厂家提供的定值质控物计算其回收率或者偏差来验证其正确度,且每个样品重复测定3次。正确度要求:偏差不应该超过10%。

1.3.3 线性范围评价 操作参考CLSI EP6-A方案要点,并通过改良Doumas法分析其线性范围数据。具体要求如下:选择接近预期线性范围上限和下限的两个分析浓度的病人血清标本,分别作为实验所需的高值样本（H）和低值样本（L）。按照1L、0.8L＋0.2 H、0.6L＋0.4H、0.4L＋0.6H、0.2L＋0.8 H、1H配制方法，制成6个不同浓度的系列评价样本，在生化分析仪上重复测定2次，在一个分析批内完成。样本的预期值为X，样本的两次测定值的均值为Y，得回归方程Y=b0+b1X。

判定结果：若相关系数R2>0.95，说明预期值与测量值之间相关性极好；当b1很接近1(一般以b1在1±0.03 范围内)，b0接近于0(若b0不接近0，需满足截距b0与0差异的t检验呈无显著性差异)，则可判断该测定方法在所涉及的浓度范围内呈线性。

1.3.4 临床可报告范围 收集接近预期线性范围上限的病人血清标本,用纯水分别进行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍浓度的稀释处理,每个浓度重复2次测定。以未稀释样本的结果作为预期值，样本稀释后测定结果为实测值,计算各稀释度下的测量回收率。回收率在90%~110%范围内，该稀释倍数是可靠的。临床可报告范围=线性范围×最大稀释倍数。

1.3.5 生物参考区间验证 参照CLSI SC28-A3文件，收集20例健康体检者血清，男女各10例，覆盖各年龄层。在生化分析仪上进行测定,确保20例测试结果不含离群值。

结果判定：如果20个测试结果中不超过2例在验证的参考区间之外，此参考区间可以接受。如果3例或以上样本超出界限，则需重新选择20例参考个体进行验证,若再次测试后不超过2例超过参考限，则该参考区间可以接受。若仍有3个或以上的观测值超出区间,则应分析原因并且考虑是否自建参考区间。

1.3.6 抗干扰能力测试 参照CLSI EP7-A2文件进行抗干扰验证试验,选取参考区间范围内患者血清标本作为测试样本，干扰物选取游离胆红素、结合胆红素、甘油三酯、血红蛋白，并分别配制浓缩20倍的各干扰物贮存液。各干扰物和测试样本按照1：19的比例配制高浓度干扰物测试样，同时用蒸馏水作为对照,按同样比例配制低浓度干扰物测试样。以高浓度干扰物测试样本和低浓度干扰物测试样本按一定比例混合一系列浓度,即75%浓度样本，50%浓度样本和25%浓度样本。每个干扰物各浓度样本测试3次,取平均值，计算其相对偏倚，偏倚超过10%考虑该浓度干扰物存在干扰现象。

1.4 统计学处理 采用MicrosoftExcel2003和SPSS 12.0 统计软件进行数据分析和统计学分析。进行简单的线性回归分析和相关性判断,对截距进行差异t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度验证结果 由于GR是比较新颖的临床检验项目,所以美国临床实验室修正法规(1988)(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88，CLIA’88)以及卫生部临床检验中心(CLSI)室间质量评价(EQA)均无该项目的评价标准。因此该项目的参照标准暂时只能与厂家声明进行比对。表1和表2结果显示,在两个浓度水平下,GR的批内C V值和总CV值都远低于厂家声明(CV≤10%)。由此可见,该国产GR试剂盒的精密度性能验证合格。

表1 低浓度水平GR精密度验证结果

表2 高浓度水平GR精密度验证结果

2.2 正确度验证结果 在精密度满足厂家申明后，参照CLSI EP9-A2方案要求,通过检测厂家提供的定值质控品来验证GR的正确度，表3结果显示，该国产GR试剂检测定值质控物靶值的相对偏差为-2.38%，远小于厂家申明的10%。因此，该试剂通过正确度验证。

2.3 线性范围的评价 采用了改良Doumas法分析表4的线性范围验证的数据,可得到图1中Y=1.0078X+3.9815的线性方程,其中R2=0.9983>0.95，斜率b1=1.0078，在1±0.03范围内，虽然截距b0不接近0，但作截距与0差异的t检验，t值为1.126

表3 GR正确度验证结果

表4 GR线性范围验证数据结果

图1 GR检测线性回归方程曲线

2.4 临床可报告范围 以GR浓度接近最高线性范围为测试样品，用厂家推荐的稀释液（纯水）进行2、4、8、16、32、64倍稀释，每个浓度重复测定2次，以样品未稀释的结果作为预期值,各稀释度下测得结果为检测值,并计算各稀释度的回收率,应在90%~110%范围内。表5数据可见，该国产GR试剂的最大稀释倍数为4,故其临床可报告范围为4~1200 U/L。

2.6 生物参考区间验证 厂家申明提供GR的生物参考区间为33~73 U/L,如表6所示,20例健康体检者的GR检测结果最高值为74.6 U/L,最低值为54.2U/L，离群值检测结果为阴性，并且仅有一例检测结果超出厂家提供的生物参考区间，故该GR试剂参考区间验证通过。

表5 国产GR试剂临床可报告范围试验

表6 国产GR试剂生物参考区间验证

2.7 抗干扰能力 依据CLSI EP7-A2文件，将不同浓度的游离胆红素、结合胆红素、甘油三酯、血红蛋白和待测血清按1:19的比例混合,各混合样本分别测定3次取均值，计算其干扰偏差；要求干扰偏差在±10%范围内。由表7结果可见,游离胆红素≤20mg/dL、结合胆红素≤20mg/dL、甘油三酯≤20mmol/L、血红蛋白≤50mg/dL时，该国产GR试剂检测结果偏差均在±10%以内,但抗干扰能力存在一定差异。

3 讨论

2018版CNAS-CL02-A003文件规定，实验室使用非配套分析系统之前,应有相应程序评估并确认正确度、精密度、可报告范围、生物参考区间等分析性能符合预期用途。为了保证检测结果的高质量，稳定和有效的检测系统是必备的前提。参照CLSI EP15-A2方案进行精密度验证,选取接近医学决定水平处的高、低双浓度水平进行实验。本实验GR两个浓度对应的批内精密度CV值为0.34%~1.65%、0.41%~1.38%,以及批总精密度CV值为2.32%、0.76%，均远低于厂家申明<10%的要求。精密度验证试验应放在其他性能验证试验之前，否则无法保证后续性能验证结果的可靠性[10]。正确度为大批检测结果的均值与真值的一致程度,通常用与正确度相反的统计量“偏倚”来表示。本验证试验依据CLSI EP9-A2方案,通过检测定值的参考物来计算回收率以评价其正确度。该GR试剂验证相对偏差为-2.38%，小于厂家申明的10%。由此可见，该GR检测系统正确度良好。线性范围又称分析测量范围，是指样本未经任何处理（稀释、浓缩或其他预处理），由检测系统直接测量得到的可靠结果范围,在此范围内一系列不同样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比例关系。而临床可报告范围是指患者标本经稀释、浓缩或其他处理后，向临床所能报告的结果范围[11]。参照CLSI EP6-A文件和改良Doumas法，本次实验得出线性方程为Y=1.0078X+3.9815，其中R2=0.9983>0.95，斜率b1=1.0078在1±0.03范围内，截距b0与0做t检验,结果显示无显著性差异。故其线性范围在4.9~277.4U/L内良好,符合厂家申明的线性范围4~300U/L，且最大稀释倍数为4，临床可报告范围为4~1200U/L。确定本检测系统精密度和正确度符合实验室要求后,仍需验证厂商提供的生物参考区间。按照CLSI SC28-A3文件的要求，检测20例健康体检标本，确保20例测试结果不含离群值。通过测试计算，95%测试结果均在厂家声明的参考区间33~73U/L以内，即该试剂的生物参考区间验证符合厂家要求。为了进一步了解黄疸、脂浊、溶血是否影响GR的检测结果,故选取游离胆红素、结合胆红素、甘油三酯、血红蛋白等干扰物,参照CLSI EP7-A2文件验证其抗干扰能力。干扰实验结果表明，当游离胆红素≤20mg/dL、结合胆红素≤20mg/dL、甘油三酯≤20mmol/L、血红蛋白≤50mg/dL，对试剂检测无明显干扰。故该GR试剂对黄疸和脂浊耐受性良好，溶血会产生一定程度的正偏离。

表7 不同浓度干扰物对GR检测结果产生的偏差

综上所述，此次研究对该国产GR试剂盒检测的精密度、正确度、线性范围、临床可报告范围、生物参考区间、抗干扰能力等性能验证的结果良好，各性能指标均符合厂家申明以及CLSI相关文件的要求，保证了测试结果的准确、可靠，可应用于临床分析研究。