循环肿瘤细胞技术临床应用的前沿进展

胡志远，李雪杰

（1.国家纳米科学中心，北京北京100190；2.福建医科大学基础医学院，福建 福州3501221）

癌症是严重威胁全球生命健康的主要疾病。2021年初，由美国癌症学会（American Cancer Society,ACS）学术期刊CA：A Cancer Journal for Clinicians（IF=292）发布了最新版Global cancer statistics 2020[1]。数据显示：在2020年，全球估计有1,930万例新发癌症病例和1,000万例癌症患者死亡。良性肿瘤与恶性肿瘤最重要的区别之一在于后者具有较强的转移侵袭能力，可向远端器官转移，而这往往是导致患者死亡的最终原因[2]。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC)的概念由澳大利亚病理学家Thomas Ashworth在18 69年第一次提出[3]。是指从恶性肿瘤组织中脱落,进入外周血循环的肿瘤细胞。CTC通常是指上皮来源实体瘤释放到外周血的肿瘤细胞，远端转移是通过外周血进行的，CTC是肿瘤转移的种子，在肿瘤转移过程中起到关键作用。

1 循环肿瘤细胞概述

CTC具有显著的异质性。恶性肿瘤具有异质性的特点,同一患者的不同部位肿瘤之间或者同一肿瘤部位的不同细胞之间或同一患者同一肿瘤不同阶段的基因和表型各不相同（时空异质性）[4]。因此CTC也具有极强的异质性,根据其物理学和生物学的不同特征可分为许多不同亚型。不仅其细胞表面抗原表达谱会有差异,且细胞大小、核质比、细胞表面特性也不相同。

多数CTC具有上皮细胞特征。上皮组织来源的恶性肿瘤约占所有恶性肿瘤病例的80%到90%，因此大多数的CTC具有上皮细胞的特性，这是CTC富集检测的病理学基础。

近年来，肿瘤免疫治疗发展迅速，其中最有效的方法之一是对免疫检查点的抑制,以程序性死亡受体/配体(PD-1/PD-L1)为主要的治疗靶点，阻断肿瘤的免疫逃逸机制[5]。但并非所有肿瘤患者都能从该靶点治疗中获益,故寻找明确的生物标志物以在早期预测和评估疗效是非常重要的。有不少研究指出，液体活检CTC可在早期及治疗进程中对PD-L1的表达状态进行动态监测[6]，所以CTC联合PD-L1的检测可能成为液体活检临床应用的新趋势。

2 CTC的检测技术

由于外周血中CTC含量极其稀少，在105～107个血细胞中仅有一个CTC[7]，因此首先需要高效率捕获富集患者血样中的CTC之后再将富集的细胞进行各种分析鉴定,以细胞计数或分子分型等形式为临床提供诊断信息。

2.1 CTC分离富集技术 富集技术主要分为基于免疫亲和性或基于生物物理特性(细胞大小、密度、变形性、电荷特征等)进行捕获。目前应用最为广泛的是以免疫亲和为基础的富集技术,采用与适当基质(如磁珠)结合的抗体、核酸适配体或多肽与CTC表面靶抗原结合,通过磁力或其它作用力进行阳性或阴性选择实现CTC的富集。阳性选择是直接通过CTC表面某些特殊的生物标志物,如上皮细胞黏附分子（EpCAM)富集相应的抗体捕获CTC；阴性选择则利用白细胞表面特异性抗原(主要为CD45)去除血液中白细胞进而富集CTC。

CellSearch检测系统由美国强生子公司（Veridex公司）研发，是全球唯一通过FDA（2004年）和NMPA（2020）批准用于CTC临床诊断的系统。该系统利用抗EpCAM抗体包裹的铁磁流体纳米颗粒阳性富集表达EpCAM的CTC细胞。在2020年NMPA批准的临床用途包括：用于全血中的上皮源性的CTC的计数检测,主要用于对恶性肿瘤患者进行动态监测以辅助判断疾病进程或治疗效果。可见上皮源性循环肿瘤细胞的临床证据较为充分,已经获得医学界和监管部门的广泛认可。但是该系统的灵敏度不足一直是其广泛临床应用的障碍。

为解决该系统灵敏度不足的缺陷,中科院国家纳米科学中心自主研发了TumorFisher技术[8],构建了高特异识别EpCAM的多肽替代抗体来富集CTC。由于多价态效应和纳米结构优化使多肽纳米磁珠与肿瘤细胞结合力优于抗体磁珠,靶向性更好，结合位点更多，因此检测灵敏度大大优于抗体磁珠，从而提高了对EpCAM低表达的CTC细胞识别捕获。该技术在乳腺癌预后和动态监测、肺癌的早期诊断以及消化道肿瘤PD-1药物疗效预测[9]等方面展现了巨大的临床应用价值,为业界所关注与重视。

备受关注的阳性富集技术还有CTC-chip，是一种基于免疫亲和性及微流控芯片的CTC富集技术，在970mm2的表面，排列了78,000个被EpCAM抗体包被的硅柱,将全血中的CTC吸附到芯片上以达到高效率CTC的捕获[10]，虽然目前已发展到第三代技术,但该系统仍缺乏大样本临床试验数据支撑,另外芯片的高成本也使其临床应用受到了限制。

2.2 CTC的分析鉴定 经过有效富集之后需对CTC进行分析鉴定，可分为免疫荧光鉴定技术、分子检测技术和基于细胞功能异常的检测技术等。

2.2.1 免疫荧光鉴定技术 目前已经获得大量的临床数据支持。NMPA最新批准的CellSearch检测系统，包括磁流体捕获试剂和荧光免疫试剂，检测流程为：将7.5ml血样经免疫磁珠分离富集,获得Ep CAM阳性的细胞,再经免疫细胞化学技术鉴定CTC并进行计数。在分析鉴定中，需将富集的细胞进行标记,如上皮标志物细胞角蛋白-藻红蛋白、白细胞标志物CD45-异藻蓝蛋白和DAPI标记有核细胞。之后通过荧光显微镜对细胞进行扫描，当细胞的形态学特征表现为EpCAM+、CK+、CD45-和DAPI+，即判定为CTC。国内外的大量临床研究都证实了该系统的临床价值。Cristofanilli M等[11]使用CellSearch检测系统对来自18个队列，2,436例转移性乳腺癌患者的7.5ml血样进行分析，以CTC计数≥5个为阈值。经过数据汇总分析发现，CTC计数≤5个的患者具有比CTC的计数≥5个的患者更长的中位总生存期 (36.3 months vs.16.0 months,P<0.0001)。Trapp E等[12]对1,087例乳腺癌患者使用CellSearch系统在化疗之前和2年之后（198名患者，18.2%，CTC阳性）评估了CTC的存在，得出结论：化疗2年后CTC的存在与总生存期（Overall survival,OS）和无病生存期（Disease-free survival,DFS）降低有关。

基于临床试验数据，2018年AJCC第八版将CTC列入乳腺癌预后评估工具[13]；2019年在中国临床肿瘤学会(CSCO)中,将CTC写入了《2019CSCO乳腺癌诊疗指南》。最近研究发现，基于免疫荧光检测来分析CTC,可以发现患者肿瘤细胞是否存在某些治疗分子靶点，从而优化患者的靶向治疗。目前临床证据较多的是消化道癌PD-L1和乳腺癌HER2等药物靶点的疗效预测。

2.2.2 分子检测技术CTC具有与原发肿瘤相似的基因组[14]，因此分子检测技术可进一步在CTC计数的基础上分析其分子特征进行分子分型，评估基因的变化，探索疾病的分子演变机制。分子检测技术要求从活的CTC中分离核酸,之后检测其中基因的突变或DNA甲基化[15]。目前检测技术包括荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链式反应(PCR)和高通量测序法(Next generation sequencing,NGS)等。

2.2.3 基于细胞功能异常的检测技术 是利用肿瘤细胞所具有的生物学行为特性鉴定血液中的CTC。这些特征包括维持增值信号，逃避生长抑制，抑制细胞死亡，无限自我复制，诱导血管生成，激活侵袭转移，逃避免疫清除，促进肿瘤炎症，能量代谢异常和基因组不稳定这十大特征[16]。由于各种癌症普遍具有这些功能性特征,因此有可能以较高特异性区分肿瘤细胞与正常细胞。基于肿瘤细胞能量代谢异常鉴定CTC的原理是在氧充足的情况下,肿瘤细胞具有与正常细胞不同的能量代谢途径,即肿瘤细胞不以三羧酸循环而主要以糖酵解的途径进行糖代谢，表现为葡萄糖摄取率高（Warburg effect）[17]。有研究通过荧光标记葡萄糖类似物（2-NBDG）表征细胞的葡萄糖摄取能力，并加入白细胞标志物CD45高通量鉴定肺癌患者胸腔积液和外周血液样本中的肿瘤细胞。即CD45-，2-NBDG高摄取的细胞鉴定为高代谢活性的肿瘤细胞，并通过单细胞测序来验证鉴定结果。结果表明，对于肺癌患者的胸腔积液和外周血液样本,鉴定的肿瘤细胞中超过60%的细胞检测到了与原位肿瘤一致的基因突变，证明基于能量代谢异常检测体液样本中的CTC具有较高的特异性[18]。

以上三种技术路径,第一种免疫荧光鉴定技术临床证据最为充足、临床应用更为广泛,以CellSe arch技术与TumorFisher技术为代表,得到医学界与学术界广泛认可。

2.3 CTC的单细胞测序 单细胞测序技术能从单个肿瘤细胞水平分析肿瘤的异质性,包括基因单个碱基突变（Single-nucleotide variants，SNV）、短序列插入/缺失（Insertions and deletions,Indel）和基因拷贝数变异（Copy number variants，CNV）等以及基因表达差异和蛋白质修饰差异等[19]。利用单细胞测序技术分析CTC,可为临床提供微创的方法来表征肿瘤的异质性以及监测肿瘤的转移机制[20]。Paoletti C团队[21]在12例乳腺癌患者中获得可评估CTC基因组的76个样本（单细胞或合并细胞），分析此前研究确立的来自乳腺癌患者CTC测序的130个基因与肿瘤组织单细胞检测结果的比较,发现二者至少一种或多种体细胞突变和基因拷贝数变异达到了85%的一致性。该结论支持CTC测序可以提供有关肿瘤异质性的重要信息。Chemi F[22]等利用单细胞测序技术分析肺静脉CTC基因组,发现相比于在原发肿瘤的突变特征的重叠,肺静脉CTC基因在10个月后的转移灶中有更高的突变重叠（91%vs.79%）,由此可分析肿瘤的转移机制进行早期干预。对于新兴的强有力武器—CTC单细胞测序，目前处于起步阶段，仍需大量的临床试验来证明其临床应用价值，真正实现由科学研究向临床应用的转化。

3 CTC临床应用存在的挑战

CTC在肿瘤学领域的临床应用价值已有大量的临床试验证实[23]。主要包括肿瘤复发的早期诊断、判断预后以及疗效监测，实现对患者的精准医疗。但是由于CTC的特殊性质，将其研究成果转化应用于临床还存在着许多问题和挑战。

3.1 CTC是血液中非常稀有的细胞，研发适宜CTC培养的技术平台进行后续功能的分析具有高度的挑战性 若能够富集活的CTC就可以进行下游分子分析（DNA,RNA,蛋白质组学表征），从分子水平对细胞的药物反应进行分析,将更清楚地了解肿瘤的发生机制以及治疗靶点[24,25]。

3.2 肿瘤细胞具有高度异质性且转移过程中会发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[26],且循环肿瘤细胞团也为CTC计数增添了难度 随着肿瘤的生长,有一部分肿瘤细胞会调控特定分子,发生表达谱的改变而发生上皮-间质转化。发生EMT的CTC增加了在外周血中的存活能力。但是CTC要转移出血管，移植到其它组织器官，又需要转变回上皮表型,称为间质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition，MET)。因此CTC可被分成上皮型、间质型和上皮间质混和型，并且这几种类型是在不断动态转化的。有研究表明，混合型CTC的生存和转移能力最强。上皮型和混合型的CTC可通过细胞表面EpCAM蛋白而被识别捕获,而间质型CTC可通过细胞表面细胞表面波形蛋白(CSV)或N-钙粘蛋白(N-Cadherin)蛋白分子捕获。鉴定各种亚型的CTC需要寻找多种具有特异性的肿瘤标志物进行联合检测,如上皮细胞型标志物（CK、EpCAM和叶酸等）、间质型标志物（波型蛋白、纤维连接蛋白1等）和肿瘤相关抗原（甲胎蛋白、癌胚抗原和PD-L1等）。通过多种标志物进行联合检测将更好地研究肿瘤的异质性,指导临床医生对患者进行个体化治疗。部分CTC聚集成团，形成循环肿瘤细胞团（Circulating tumor microemboli,CTM）,其转移潜能比单独CTC高23-50倍[27]。由于CTC具有高度异质性,这是全世界医学界和产业界面临的共同难题。因此寻找肿瘤细胞的特异靶标，优化CTC鉴定方法，包括CTM的联合检测，都是使CTC应用于临床亟需突破的瓶颈,目前的解决方案是由厂家提供自身产品标准,根据其CTC亚型的特点找到其诊断应用。

3.3 目前市场上CTC的检测平台众多，各个平台对标本检测前的处理流程以及检测流程有很大差异[28]，除了CellSearch系统在大量的临床试验中进行了验证，在使用CTC计数应用于临床时，不同的平台其cut-off值尚无定论 因此需要通过大样本的临床试验以规范操作流程,建立统一标准使得检测结果具有可比性和稳定性。近年来人工智能技术在临床病理研究中进展迅猛,未来在CTC中的临床应用可以期待。

4 CTC用于精准医学——在PD-1/PD-L1免疫治疗中的应用

肿瘤治疗经历了从传统治疗到靶向治疗以及近几年发展迅速的免疫治疗,使得肿瘤治疗取得了显著的进展。其中免疫检查点抑制疗法备受关注，代表性药物为程序性死亡受体1（Programmed cell death 1,PD-1）及其配体（Programmed cell deathligand 1,PD-L1）抑制剂[29]。PD-1/PD-L1结合产生共抑制信号阻断T细胞的活化,从而发生了免疫逃逸[30]，而免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1药物即作用于该靶点以活化T细胞来进而杀伤肿瘤细胞。

自从2014年FDA批准PD-1抗体Pembrolizumab和Nivolumab用于治疗晚期黑色素瘤，国内外已有大量PD-1/PD-L1抑制剂药物在不同癌种获批应用。尽管免疫疗法显示出巨大的临床应用价值，但仅有部分患者可以从该疗法中获益，因此治疗前从患者中早期精准筛选出最佳响应个体显得尤为重要。目前临床研究中的肿瘤免疫治疗生物标记物包括：⑴通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测PD-L1在肿瘤细胞中的表达水平[31]；⑵肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden,TMB）检测，TMB越高，肿瘤的免疫原性越高，从肿瘤免疫治疗中获益的可能性就越大[32]。⑶基因错配修复和微卫星不稳定（MMR/MSI），MMR/MSI是FDA批准的抗PD-1/PD-L1治疗的伴随诊断标志物[33]。但这些检测采用的组织活检具有侵入性和无法反复获取,且肿瘤组织具有异质性使这些检测结果不够精准[34]。Carbognin L[35]报道,在511例肿瘤组织PD-L1阳性的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中,采用Nivoluma治疗的患者其客观缓解率（ORR）仅在16%到50%之间。证实了从肿瘤组织检测PD-L1的局限性。液体活检CTC技术的出现或许可以弥补传统检测方法的不足[36]。

4.1 CTC检测为解决以上难点提供了新的思路无需进行组织活检，即可实现实时动态无创取样，从而预测免疫治疗疗效，且在治疗过程中实时监测以提供肿瘤耐药的信息。2015年Mazel M[37]等首次在转移性乳腺癌患者的血液中检测到表达PDL1的CTC。

4.1.1 用药前PD-L1高表达CTC可预测PD-1药物疗效 徐建明团队[8]对35例晚期胃肠道肿瘤患者进行了抗PD-1治疗的1期临床试验(IBI308)。该研究团队利用TumorFisher技术,建立了首个PD-L1表达半定量荧光分析体系,将患者按照基线CTC-PD-L1表达水平进行分层（PD-L1阴性、PD-L1低表达、PD-L1中等表达和PD-L1高表达）。PD-L1高表达比例≥20%的患者对药物的客观响应率高达64%,而比例＜20%的患者的客观响应率只有14%；PD-L1高表达比例≥20%的患者比PD-L1高表达比例＜20%的患者具有更长的中位无进展生存期 （4.27 months vs 2.07 months,P=0.002）。

4.1.2 CTC-PD-L1检测在双药联用也有更好的疗效预测价值 徐建明利用TumorFisher CTC检测体系，探究PD-1免疫检查点抑制剂SHR-1210联合阿帕替尼在治疗晚期肝癌、胃癌和胃食管交界处癌的疗效预测[38]。41例患者在治疗前采取外周血，检测外周血中CTC-PD-L1的表达水平，39例,灵敏度95.1%,血液中检测到CTC；35名可评估患者中有29名（82.9%）患者有PD-L1高表达的CTC。CTC-PD-L1高表达比例≥20%为阈值,PD-L1高表达CTC的患者中ORR为47.8%（11/23例）,而低表达的患者中客观缓解率ORR为0%（0/12例,P=0.002）。此外，CTC-PD-L1高表达的患者具有更长的无进展生存期（中位数6.1 months vs.2.9months,HR:0.28,95%CI:0.12-0.67；P=0.0002）且OS显著延长 （median NR vs.8.9months,P=0.0601）。提示CTC-PD-L1表达水平可作为抗PD-1/PD-L1免疫治疗的预测指标和对患者进行分层的生物标志物。

5 小结和展望

CTC在肿瘤早期筛查、动态监测以及免疫治疗选择等方面的研究取得了显著成果，CTC检测是目前最具发展潜力的非侵入性肿瘤诊疗手段之一。虽然目前由研究成果的临床转化还面临许多挑战,但随着富集技术的不断提高以及鉴定不同类型CTC特异性生物标志物的发现，CTC检测的敏感性和特异性将显著提升。与常用的肿瘤诊断方法如影像学证据和组织活检相比，CTC检测具有早期、高效、取材方便和可重复监测等优势。与常规肿瘤标志物检测相比，CTC检测通常能更早反映疾病的变化。CTC分子分析能获得的大量信息，弥补目前医疗手段的不足,特别值得指出的是CTC单细胞测序技术未来将有广泛的应用前景和发展空间，对于了解实体瘤的进化过程及患者个体化治疗具有巨大的意义。