RhD 阴性围产期妇女RHD 基因分型及Rh 表型分析

韩 雪 韩红梅 李 捷（通信作者） 天津市第五中心医院输血科（天津，300450）

Rh 血型系统是人类红细胞血型系统中最具有高度多态性的一个，抗原复杂多变，最常见的有D、E、C、c、e 5 种抗原，D 抗原是Rh 血型抗原中免疫原性最强的， 由RHD 基因编码，10 个外显子组成，编码区总长为1 251 bp， 编码417 个氨基酸组成的糖蛋白， 且存在多种变异体， 包括部分D 型（partial D）、弱D（weak D）型、DEL 等，是临床上引起新生儿溶血病、溶血性输血反应的最主要的血型抗原，对D抗原阴性的孕妇的妊娠具有重要的临床意义。 关于Rh 阴性个体的血清学表型、RHD 基因型检测分析一直是国内外研究的热点，不同地区、民族皆对其有相关报道。本研究旨在对RhD 初筛阴性的孕产妇RHD 基因分型进行研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2016 年1 月～2019 年6 月共收集本院产科就诊的围产期妇女标本10 139 例， 其中RhD 抗原血清学初筛试验阴性标本104 例，每例留取EDTA 抗凝血标本约5 ml。

1.2 试剂与仪器

ABO、RhD 血型定型检测卡 （单克隆抗体）（生产批号20151204、20161204、20171204、20181204，长春博讯生物技术有限公司）。 RhD 血型抗原检测卡 （单克隆抗体）（生产批号20160601、20170601、20180601，长春博讯生物技术有限公司）；TD-3A 型血型血清学离心机（长春博讯科研仪器有限责任公司）移液器（Eppendrof 公司）。 核酸提取或纯化试剂盒（天津秀鹏，生产批号201808001）；人类红细胞RHD 基因分型试剂盒（PCR-SSP 法）（天津秀鹏，生产批号201810002）；琼脂糖（Biowest）EB 染料（天津秀鹏，生产批号201703001）；JY300C 电泳仪（北京君意东方电泳有限公司）；PCR 扩增仪（美国应用生物系统（ABI）公司9700 型）；GenoSens1860 凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 Rh 抗原检测

采用RhD 血型抗原试剂卡检测D、C、c、E、e 5种抗原，操作步骤按照试剂卡说明书进行。

1.3.2 基因组DNA 的提取

严格按照天津秀鹏生物技术开发有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒说明书操作， 提取104 例经抗人球蛋白法确定为RhD 阴性的样本的基因组DNA 备用。 DNA 产物应该保存在-20 ℃，以防降解。

1.3.3 PCR 检测

将80μl dNTP-Buffer 工作液、0.8 μl Taq 酶和10 μl DNA 总共90.8 μl 混合液漩涡混匀并瞬时离心；向每个引物孔（1～8 孔）各加入10 μl 上述混合液。 PCR 循环参数为96 ℃2 min，1 个循环；96 ℃20 s，68 ℃60 s，5 个循环；96 ℃20 s，65 ℃50 s，72 ℃45 s，10 个循环；96 ℃20 s，62 ℃50 s，72 ℃45 s，18 个循环；72 ℃5 min，1 个循环。 将PCR 产物移至2.5%琼脂糖凝胶电泳孔中， 电泳参数设置为140-150 V，电泳15-20 min，电泳后紫外光下成像仪拍照记录并对照说明书判读结果。

2 结果

2.1 Rh 血型系统抗原检测

104 份阴性标本均未发现CCEe、CcEE 及CCEE 表型，见表1。

表1 RhD 初筛阴性孕产妇标本Rh 血型系统分型结果

2.2 104 例RhD 阴性围产期妇女标本RHD 基因分型

RHD 基因全缺失型70 例， 占全部阴性标本的67.3%；DEL RHD 1227A 纯合型标本13 例，占全部阴性标本的12.5%；RHD-CE （2-9）-D 标本10 例，占全部阴性标本的9.6%；弱D15 型标本5 例，占全部阴性标本的4.8%；DEL RHD 1227A 杂合型标本2 例，占全部阴性标本的1.9%；RhD 阳性标本2 例，占全部标本的1.9%，判读为D 变异体；另外有2 例不能用此PCR-SSP 试剂盒确定其基因型，占全部标本的1.9%。图1-6 为RHD 基因分型PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳的条带格局表2 显示不规则抗体筛查检出3 例阳性，其抗体为抗-D，基因分型均为全缺失型。

表2 104 例RhD 初筛阴性围产期妇女标本RHD 基因分型结果

图1 RHD 基因全缺失型

图2 DEL RHD1227A 纯合型

图3 RHD-CE（2-9）-D 型

图4 弱D15 型

图5 DEL RHD1227A 杂合型

图6 RhD 阳性

2.3 104 例不同D 表现型在RhCE 表型中的分布见表3。

表3 104 例不同D 表现型在RhCE 表型中的分布[n（%）]

3 讨论

Rh 血型系统最具复杂多态性，在临床输血体系中占有重要地位，仅次于ABO 血型系统。 本次实验104 例RhD 阴性标本的血型抗原分型中以ccee（54.8%）和Ccee（27.9%）频率最高，而基因分型中以RHD 全缺失型为大多数， 占全部标本的67.3%，其Rh 表型主要是ccee（78.6%），说明RHD 全缺失型与ccee 表型具有高度关联。 Del 型主要是Ccee（69.2%），RHD-CE（2-9）-D 型主要是Ccee（60%）。

D 抗原因具有多种变异体而具有复杂多样性，不同民族和遗传背景均有不同。有研究表明是RHD基因之间产生的氨基酸重排和基因突变影响了抗原的表达［1］，目前发现亚洲人群中存在部分D（partial D）、弱D（weak D）、Del 等变异体。 部分D 主要有RHD-CE（2-9）-D、DVIⅢ型、RHD-CE（2-7）-D2等类型， 是由于RHD 基因与RHCE 基因在方向上相反，有很大的几率产生替换，表现为缺失1 个或多个抗原表位，且易被致敏产生对应缺失的抗原表位的抗体。 RHD-CE（2-9）-D 型是中国人群中主要的等位基因，其分子机制是缺少2～9 外显子，本研究中共发现10 例， 分别在表型Ccee、ccEe 中检出，与先前国内学者检测RHD-CE （2-9）-D 等位基因存在于CDe 单体型中的结果不一致，表明RHD-CE（2-9）-D 等位基因与RhC/E 抗原之间没有明确联系。

Becker 等［2］采用Southern 分析技术及PCR 基因定型分析了弱D 中RHD 基因表达情况， 发现弱D 在基因水平及转录水平和正常D 相比没有任何差异，所以认为其在基因数量上引起变异，而非碱基对的结构变异， 导致红细胞膜上的抗原数量减少，而抗原表位不变。 另一些研究认为，弱D 是由于发生了氨基酸替换和外显子突变［3］。 如果弱D 型供血者的红细胞输注给了Rh 阴性患者， 可刺激机体产生同种免疫， 产生IgG 抗体而引起严重的溶血性输血反应。 其中弱D 最常见有弱D15 型和弱D12型，而弱D15 型在中国人群中被广泛发现，同样可激发同种免疫反应，所以应该重视对弱D15 型的检测。 本次实验共检测出5 例弱D15 型，血清分型分别是Ccee（60%）和CcEe（40%）。

Del 型极弱表达D 抗原， 只有通过吸收放散的方法才能检测到， 输注给Rh 阴性患者仍会产生免疫应答，并且各地Del 表型的分子机理各有其特点，中国汉族人群的研究资料表明，Del 型主要由RHD1227A 等位基因编码组成［4-5］。 亚洲Rh 阴性个体中，Del 表型占有较高比例， 高加索人RhD 初筛阴性个体中Del 型占0.33%［6］， 国内报道为15.6%-29.95%［7-9］。本研究检出Del RHD1227A 型15 例，占14.4%，说明Del 型的分布存在一定的地区差异。 其血清表型分别为Ccee、CCee 及CcEe， 推测1227A可能与C 抗原相关， 但由于本次研究标本量较少，这一观点还需要大量标本进一步研究证实。 虽然DEL 型具有完整的RHD 基因， 但极弱的表达D 抗原，因此临床上将把它归为RhD 阴性。 有研究发现DEL 型与正常D 抗原相比，具有很少的抗原分子数量， 每个红细胞上的D 抗原分子数量可能在30 个以下［10］，1227A 因其位于第9 外显子最后一位，影响了mRNA 的正常连接，形成了短的mRNA，从而降低了RHD 基因的表达效率， 也就造成了红细胞膜上的D 抗原分子数量明显减少。 邵超鹏等［11］研究说明，编码RhD 1227A 等位基因的中国汉族Del 个体100%携带RHD 基因。 如果Del 型个体表达完整的D 抗原，Del 个体将可能不会被D 抗原免疫产生免疫应答， 本文中104 例标本中有3 例产生了抗-D，其基因型均为全缺失型，可以印证上述观点，也就是说Del 患者可以输注RhD 阳性红细胞而不产生抗-D 抗体，Del 型女性妊娠RhD 阳性胎儿将可能不会引起新生儿溶血病。 即对于这部分孕妇，在整个孕期及产后不需要注射RhD 免疫球蛋白，可免去产妇对注射免疫球蛋白产生的风险和经济负担，以及对是否产生抗-D 影响胎儿的心理压力。 目前，国际上均不对Del 型进行检测，将其作为RhD 阴性血型对待，供给RhD 阴性患者使用，而由于输注Del 血液产生抗-D 的病例并不罕见，这无疑存在很多弊端和风险， 国外已有学者发现RhD 阴性孕产妇被Del 型胎儿或红细胞免疫和RhD 阴性受血者输注Del 型血液而产生抗-D 抗体的病例［12-14］，由此可见，结合血清学检查和RHD 基因分型对RhD 阴性产妇和临床输血均具有重要的意义， 检测围产期孕妇的RHD基因型并筛查其血清抗体，可对RhD 阴性孕产妇二次妊娠及新生儿溶血病的及时预防提供重要依据。

通过本次研究， 基本确定了Rh 阴性个体的基因分型情况， 但仍有部分个体的基因型通过此PCR-SSP 法无法确定，需对其外显子测序才能明确其基因型。 也证实了RhD 阴性个体的D 基因多态性，研究RHD 基因的变异，对人类输血安全和新生儿溶血病的防治具有重要意义。