miR-103a-3p对肝细胞癌细胞迁移能力的影响及其作用机制

(青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系，山东 青岛 266071)

肝细胞癌(HCC)是临床最常见的致死性恶性肿瘤[1-2]，首选治疗方法仍然以手术切除为主，但由于HCC具有侵袭性强、肝内转移等特点，其术后高复发率严重影响患者预后[3-5]。近年来，HCC分子靶向药物治疗取得显著进展，但是靶向药物治疗带来的不良反应也不容忽视，严重影响了患者的依从性和疗效[6-8]。

MicroRNAs(miRNAs)是一类由18～25个核苷酸组成的微小的非编码单链RNA分子，能够通过碱基配对在转录后水平上通过降解mRNA或者阻止mRNA翻译来沉默mRNA，发挥其基因调控作用[9-10]。miR-103作为miRNAs家族中的一员，包括miR-103-1和miR-103-2两种类型，miR-103a-3p是miR-103-1中常见的一种亚型。近年来研究发现，miR-103在多种组织中呈异常表达，其与肿瘤的发生发展密切相关[11]。在结直肠癌中，miR-103通过靶向死亡相关蛋白激酶(DAPK)和Krüppel样因子4(KLF4)促进结直肠癌的转移，miR-103还可靶向下调E-钙黏着蛋白(E-cadherin)促进结直肠癌的侵袭[12]。在胃癌中，miR-103a-3p通过靶向转录激活因子7(ATF7)促进人胃癌细胞增殖[13]。提示miR-103可以作为潜在的生物标志物用于癌症的诊断和治疗。

内质网跨膜蛋白166(TMEM166)基因，又称作FAM176A或者EVA1A，是2007年鉴定出来的一种参与细胞自噬与凋亡的基因[14]。研究发现，TMEM166在HCC中能够被miR-125b靶向下调，从而可以增加HCC细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性[15],提示TMEM166在HCC中低表达可能是受到了miRNAs的靶向调控。但是miR-103a-3p对TMEM166是否存在靶向调节以及是否通过TMEM166调控HCC细胞的迁移，目前尚不清楚。本研究拟探讨miR-103a-3p对HCC细胞迁移的影响及其作用机制，为进一步寻找HCC的诊断和治疗靶点奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常肝细胞L02、人HCC细胞系Hccl-M3与293T细胞来自于青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学实验室。

1.2试剂

DMEM/HIGH GLUCOSE培养基(美国HyClone公司)，青链霉素混合液(美国sigma公司)、RIPA蛋白提取试剂盒(中国赛默飞世尔科技有限公司)，Trizol RNA提取试剂(日本TaKaRa公司)，miR-103a-3p mimics、miR-103a-3p inhibitor以及其阴性对照NC(上海汉恒生物科技有限公司)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，兔抗人TMEM166多克隆抗体(英国Abcam公司)，RT-PCR试剂盒、RNA反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)，TMEM166引物(北京擎科新业生物公司)。

1.3 细胞培养

将人正常肝细胞L02、HCC细胞系Hccl-M3接种于含体积分数0.10胎牛血清和体积分数0.01青链霉素溶液的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱内，培养至合适密度后用于后续处理。

1.4 研究方法

1.4.1实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测正常肝细胞L02和HCC细胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表达水平 采用Trizol法提取常规培养的细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以此为模板进行RT-qPCR。根据试剂盒说明书配制反应体系，以U6作为内参照，每个样品设3个复孔。实验重复3次。采用2-△△CT计算样本中miR-103a-3p mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.2Western blot方法检测细胞中TMEM166蛋白的相对表达量 取对数生长期的Hccl-M3细胞，以每孔约5×105个细胞数接种于6孔板中，待细胞融合度为40%左右，将细胞按照实验要求分为A、B、C、D组，各组分别转染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor，转染72 h后，弃掉培养基，用PBS洗涤2次，按照PMSF∶RIPA=1∶100的比例配置蛋白裂解液，提取总蛋白。用BCA蛋白试剂盒检测蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后高温加热使蛋白变性。按照SDS-PAGE凝胶制备说明书配置150 g/L的分离胶及50 g/L的浓缩胶，电泳、转膜，然后以50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶500)室温孵育2.5 h，以β-actin作为内参。TBST洗膜3次后，二抗室温孵育1 h，重复上述洗膜步骤，显影，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值计算，结果取3次重复实验的均值。

1.4.3双荧光素酶报告基因活性的检测与分析构建TMEM166野生型3′-UTR(TMEM166-3UTR-wt)和突变型3′-UTR(TMEM166-3UTR-mu)荧光素酶报告基因质粒，将293T细胞分为F、G、H以及I组，各组分别转染mimics NC与TMEM166-3UTR-wt、miR-103a-3p mimics与TMEM166-3UTR-wt、mimics NC与TMEM166-3UTR-mu、miR-103a-3p mimics与TMEM166-3UTR-mu，转染48 h后，弃掉培养基后，用PBS洗涤3次；向每个样品孔中加入100 μL Passive Lysis Buffer，充分裂解细胞15 min，将细胞裂解液转移至1.5 mL EP管中，4 ℃下10 000 r/min离心15 min，取上清液；向96孔黑色酶标板中每孔加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ工作液，再向每孔加入20 μL细胞裂解液，吹打混匀后测定记录Firefly luciferase值(内参值)；向每孔中加入100 μL 终止液，吹打混匀后检测记录Renilla luciferase值(报告基因发光值)。相对荧光素酶活性以报告基因发光值/内参值表示。结果取3次重复实验的均值。

1.4.4细胞划痕实验检测HCC细胞系Hccl-M3的迁移能力 取对数生长期的Hccl-M3细胞，以每孔约5×105个细胞数接种于6孔板中，待细胞汇合度达到40%～60%时，将细胞按实验要求分为A、B、C、D、E组，各组分别转染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor、miR-103a-3p mimics与TMEM166-Myc，转染严格按照说明书操作。转染后的细胞继续培养至细胞密度达到95%时进行划痕，于划痕后0、48 h在显微镜下观察并拍照，应用Image J软件计算划痕面积，结果取3次重复实验的均值。

1.4.5统计学方法 采用Graphpad Prism 6.0进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 正常肝细胞L02和HCC细胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA表达水平

RT-qPCR检测结果显示，正常肝细胞L02和HCC细胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA平均相对表达量分别为1.08±0.12、5.07±0.27，两者比较差异具有显著性(t=13.49，P<0.05)。

2.2 miR-103a-3p对Hccl-M3细胞TMEM166蛋白表达的影响

Western blot结果显示，A～D组Hccl-M3细胞中TMEM166蛋白的相对表达量分别为0.56±0.01、0.22±0.00、0.51±0.01、0.73±0.00，组间比较差异有显著性(F=276.20，P<0.05)；与A组相比，B组细胞中的TMEM166蛋白相对表达量明显降低(t=22.33，P<0.05)；与C组相比较，D组细胞中TMEM166蛋白相对表达量明显升高(t=9.72，P<0.05)。见图1。

2.3 miR-103a-3p与TMEM166的结合位点预测

通过starBase软件预测发现，miR-103a-3p与TMEM166存在结合位点(图2)。

A、B、C、D分别对应A、B、C、D组

图2 starBase软件预测 miR-103a-3p与TMEM166-3′UTR的结合位点

2.4 双荧光素酶活性分析结果

荧光素酶活性检测结果显示，F～I组荧光素酶的活性分别为0.99±0.02、0.56±0.02、0.98±0.02、0.96±0.02，组间比较差异具有显著性(F=122.90，P<0.05)；与F组相比，G组荧光素酶活性明显降低(t=23.17，P<0.05)，说明突变成功，结合位点预测正确，TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因。

2.5 miR-103a-3p表达对Hccl-M3细胞迁移能力的影响

划痕实验结果表明，A～E组细胞迁移率分别为0.38±0.01、0.46±0.00、0.39±0.01、0.34±0.00、0.41±0.01，组间比较差异有显著性(F=16.83，P<0.05)；与A组相比，B组细胞的迁移能力明显升高(t=4.13，P<0.05)；与C组相比，D组细胞的迁移能力降低(t=4.33，P<0.05)；与B组相比，E组细胞的迁移能力降低(t=4.91，P<0.05)。见图3。

A、B、C、D、E分别对应A、B、C、D、E组

3 讨 论

HCC是世界范围内癌症相关死亡的第3大原因[1]。目前HCC的治疗很大程度上依赖于靶向治疗，它能够特异地作用于肿瘤发生发展过程中起关键作用的靶分子及其调控的信号通路达到治疗肿瘤的目的[16-17]。近年来随着对HCC致病机制的深入研究发现，microRNA在HCC组织中表达异常，广泛参与HCC的发生发展过程，对HCC增殖、凋亡及转移有重要的调节作用，成为HCC诊断、治疗以及患者预后的重要靶点[18-20]。目前，HCC的发生发展机制尚不完全清楚，因此，探索其发生发展的分子机制对于寻求HCC诊断、治疗的新靶点极为重要。

miR-103与人类多种恶性肿瘤密切相关，其在多种组织中表达异常发挥抑癌或促癌作用。在非小细胞肺癌中，miR-103通过直接靶向程序性细胞死亡因子10(PDCD10)发挥抑癌作用[21]；在神经母细胞瘤、胃癌、乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌中，miR-103通过靶向调控特定的基因发挥促癌作用[22-26]。在本研究中，首先鉴定了miR-103在HCC中的表达情况，再进一步研究其对HCC细胞迁移能力的影响。RT-qPCR结果显示，HCC细胞系Hccl-M3中miR-103a-3p mRNA水平显著高于正常肝细胞L02。细胞划痕实验结果显示，上调miR-103a-3p表达后，Hccl-M3细胞迁移能力明显提高，说明miR-103a-3p表达可促进人HCC细胞迁移。为了探讨miR-103a-3p调控细胞迁移的分子机制，本研究采用软件预测并通过双荧光素酶实验证实，TMEM166是miR-103a-3p的下游靶基因,进一步通过共表达miR-103a-3p和TMEM166，发现TMEM166的表达能够显著减弱miR-103a-3p对HCC细胞的促迁移作用，表明miR-103a-3p促进HCC细胞迁移可能是通过靶向下调TMEM166的表达实现的。

TMEM166是位于人2号染色体短臂12区的一种新型内质网和溶酶体相关蛋白。研究发现，与正常组织相比，TMEM16在肝癌、胰腺肿瘤、食管鳞状细胞癌等人类肿瘤组织中显著下调[27-29]，提示其可能参与了这些肿瘤的发生或发展。研究表明，过表达TMEM166能够通过诱导宫颈癌HeLa细胞、非小细胞肺癌H1299细胞、胶质母细胞瘤SHG44等的凋亡来抑制肿瘤细胞增殖[30-31]。最新一项研究表明，TMEM166能够通过上调TP53诱导细胞凋亡来抑制肝癌细胞的侵袭、迁移和增殖[27]。另有研究发现，TMEM166能够被miR-125b靶向下调从而可以增加HCC细胞的化疗敏感性[15]，提示在肝癌中，TMEM166的下调可能受某些miRNAs调控。本研究通过双荧光素酶报告基因方法证明了miR-103a-3p对于TMEM166存在靶向调控作用。并采用Western blot方法检测miR-103a-3p对于TMEM166表达的影响，结果表明，过表达miR-103a-3p能够下调TMEM166蛋白的表达，验证了miR-103a-3p对TMEM166的靶向调控作用。目前关于miR-103a-3p以及TMEM166在HCC中的研究较少，本研究通过双荧光素酶报告基因的方法,首次验证了miR-103a-3p与TMEM166的靶向调控关系，并且初步证实miR-103a-3p可以通过抑制TMEM166基因的表达促进HCC细胞迁移。

上皮间质转化(EMT)对肿瘤进展过程中细胞迁移至关重要。研究发现，在口腔鳞状细胞癌中，miR-103通过靶向调控婆罗双树样基因4(SALL4)的表达调控EMT[32]。在HCC中，miR-103是否通过靶向TMEM166参与EMT的调控还有待进一步研究证实。XIA等[33]研究显示，miR-103能够通过靶向A型激酶锚定蛋白12(AKAP12)促进HCC细胞的生长，但具体的作用机制以及该靶向调控是否与促进HCC细胞迁移有关尚不清楚。以上分析表明，除TMEM166以外，miR-103还可能通过其他靶标促进HCC细胞的迁移，因此，miR-103对HCC进展的确切机制还需要进一步研究。此外目前还有研究发现，在三阴性乳腺癌中，长链非编码RNA MIR503HG通过调控miR-103/OLFM4的表达调控细胞迁移和侵袭[34]，HCC中是否也存在长链非编码RNA对miR-103调控，也有待于进一步研究。

综上所述，本研究首次证实了miR-103a-3p通过对TMEM166基因的靶向调控作用来促进HCC细胞迁移。但miR-103a-3p靶向调控TMEM166基因发挥促癌作用的具体机制还需要进一步研究，以进一步揭示HCC可能的发生发展机制，为HCC诊断以及治疗新靶点的选择提供理论支持。