术前血清miR-186-5p 对急性冠脉综合征患者PCI术后发生主要不良心血管事件的预测价值

孙经超，田晓岚，胡瑛霞

丹东市中心医院，辽宁丹东118000

急性冠脉综合征（ACS）指冠状动脉发生粥样硬化引起的冠脉管腔狭窄、闭塞，进而导致心肌缺血缺氧性坏死，是较危险的冠心病类型，在世界范围内有较高的发病率和病死率［1-2］。行经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是目前临床挽救缺血心肌、保护心功能的首选治疗手段［3］。但PCI 术后患者冠心病危险因素仍存在，主要不良心脏事件（MACE）发生率较高。PCI 术后MACE 的发生机制涉及心肌细胞凋亡和丢失、缺血再灌注损伤、脂质代谢紊乱、内皮功能受损、动脉粥样硬化斑块形成等。微小RNA（miRNA）是具有调控基因表达功能的内源性非编码RNA，参与心血管疾病发生发展［4-5］。现有报道显示，miR-186-5p 在乙醇诱导的损伤心肌细胞中高表达，发挥调控心肌细胞凋亡作用［6-7］，被认为是缺血性心血管疾病早期诊断的潜在生物学指标。本研究拟探讨miR-186-5p 与ACS 患者PCI 后发生MACE 的关系，旨在为临床预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017 年9 月－2019 年2 月我院心内科住院部收治的150 例ACS 患者（ACS 组），纳入标准：①冠状动脉造影（CAG）检查至少1 支冠脉狭窄≥50%，符合《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》诊断标准［8］；②均行PCI 治疗，治疗后规律服药，保持随访；③实验室、影像学检查结果完整。排除标准：①采用保守治疗或行冠状动脉旁路移植术患者；②合并瓣膜病、心肌炎、心包炎等器质性心脏病；③稳定型心绞痛，心功能不全；④随访期间出现脑血管意外、感染、消化道出血等其他并发症相关死亡病例。其中男89 例，女61 例；年龄59～73 岁。另选择年龄、性别相匹配的103 例门诊体检健康者为对照组，均排除心血管疾病，男69 例，女34 例，年龄60～79 岁。两组性别、年龄资料比较具有可比性（P均＞0.05），本研究获得我院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意并签署同意书。

1.2 血清miR-186-5p 表达检测 所有ACS 患者术前及术后1、2、3、7 d（对照组于体检当日）采集肘静脉血3 mL，注入EDTA 抗凝管混匀，4 ℃、2 000 r/min离心10 min（离心半径15 cm），取上层血清于EP 管置于-80 ℃超低温冰箱保存。取血清样本加入TRIzol（美国Invitrogen 公司）充分混匀，提取总RNA，ND-1000 紫外分光光度计（NanoDrop 公司）检测RNA 纯度和完整性，选择吸光度值A260/A280RNA样品，M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）按照试剂盒说明将其转录为cDNA。CFX96 实时荧光PCR 仪（美国Bio-Rad）检测血清中miR-186-5p表达，引物合成及序列测定由上海基康生物技术公司完成。miR-186-5p 正向引物：5′-GCGCTAAGGCACGCGGT-3′，反向引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6为内参，U6 正向引物5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR 流程：将cDNA 样品分别加入qRT-PCR 反应体系（共20 μL，其中上下引物各1 μL）。反应条件：95 ℃变性10 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40 个循环。以U6 snRNA 为内参，2-ΔΔCt计算miR-186-5p 相对表达量，共做3 次平行试验，取平均值。ΔΔCt miR-186-5p=ΔCt miR-186-5p-ΔCt U6 snRNA。

1.3 观察指标 收集所有受试者社会人口学资料（性别、年龄、烟酒嗜好、家族遗传史）、基础疾病（高血病、糖尿病、高脂血症）、冠脉造影结果（冠脉狭窄程度、冠脉病变长度、术前Gensini 评分）、超声心动图结果［美国GE Vivid E9 心脏超声诊断仪（三维矩阵探头频率1.5～3.5 MHz）测量舒张末期左心室内径（LVEDD）、收缩末期左心室内径（LVESD）、左心室射血分数（LVEF）］、其他实验室生化指标［西门子ADVIA 2120 全自动血细胞分析仪检测白细胞（WBC）、血小板（PLT）水平，强生血糖仪测定空腹血糖（FPG），罗氏Modular全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），FIA8000免疫定量分析仪应用放射免疫法检测血清肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK-MB）、N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）水平，试剂盒购自四川迈克生物科技有限公司］。

1.4 随访 ACS 患者出院后随访12 个月，采用门诊或电话形式随访，每月1 次。统计随访期间MACE 发病情况，MACE 定义［7］：再次心肌梗死、血运重建、心力衰竭、心源性死亡。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料以±s表示，比较采用独立样本t 检验。计数资料比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-186-5p 对ACS 患者PCI 术后MACE 的预测价值。Kaplan-Meier 生存分析不同miR-186-5p表达ACS 患者PCI 术后MACE 发生率，Log-Rank 检验组间差异。Cox 风险回归分析影响ACS 患者PCI术后发生MACE 的危险因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACS 患者血清miR-186-5p 表达及MACE 发生情况 ACS 组术前及术后1、2、3、7 d 血清miR-186-5p 相对表达量分别为0.42 ± 0.12、0.32 ± 0.11、0.21 ± 0.09、0.21 ± 0.08、0.21 ± 0.07，对照组为0.20±0.06。ACS组术前、术后1 d血清miR-186-5p表达高于对照组（P 均＜0.05），术后2、3、7 d 血清miR-186-5p表达与对照组比较差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。术前血清miR-186-5p 表达高于术后1、2、3、7 d（P 均＜0.05），术后1 d 血清miR-186-5p 表达高于术后2、3、7 d（P 均＜0.05），术后2、3、7 d 血清miR-186-5p 表达比较差异无统计学意义（P 均＞0.05）。本组150 例ACS 患者PCI 术后12 个月发生MACE 共35 例（23.33%），其中再次性心肌梗死14例（40.00%），再次血运重建7 例（20.00%）、心力衰竭10 例（28.57%），心源性死亡4 例（11.43%），未发生MACE 共115 例。ROC 曲线分析术前血清miR-186-5p 表达预测ACS 患者PCI 术后发生MACE 的最佳截断值为0.045（灵敏度为82.86%，特异度为88.70%），曲线下面积为（AUC）为0.878（95%CI：0.808～0.948，P＜0.05），高 于 术 后1 d 的0.711（95%CI：0.605～0.816，P＜0.05），二者比较差异有统计学意义（Z=2.316，P＜0.05）。术后2、3、7 d 血清miR-186-5p 不具备诊断效能（AUC 分别为0.570、0.502、0.446，P均＞0.05）。

2.2 不同miR-186-5p 表达ACS 患者预后比较 根据术前miR-186-5p 预测ACS 患者PCI 术后发生MACE 的最佳截断值将患者分为miR-186-5p高表达组82 例（miR-186-5p≥0.045）和miR-186-5p 低表达组68例（miR-186-5p＜0.045），Kaplan-Meier生存曲线分析示miR-186-5p高表达组MACE发生率为31.71%（26/82），高于miR-186-5p低表达组的14.71%（10/68）（χ2=6.424，P=0.011）。

2.3 MACE 组和非MACE 组基线资料和临床指标比较 MACE 组和非MACE 组年龄、性别、吸烟史、饮酒史、合并高血压史、合并糖尿病史、TG、TC、FPG、LVESD、LVEDD 比较差异无统计学意义（P 均＞0.05）。MACE 组LVEF 低于非MACE 组（P＜0.05），CK、CK-MB、NT-proBNP、冠脉病变长度、冠脉狭窄率、术前Gensini 评分高于非MACE 组（P 均＜0.05），见表1。

2.4 影响ACS 患者PCI 术后发生MACE 的因素分析 多因素Cox 风险回归分析示高术前Gensini 评分、术前miR-186-5p 表达是ACS 患者PCI 术后发生MACE的危险因素（P均＜0.01），见表2。

表1 MACE和非MACE患者基线资料比较

表2 ACS患者PCI术后发生MACE的多因素Cox风险回归分析

3 讨论

PCI 血运重建可开通梗死冠脉，恢复血流供应，但是同时可导致动脉粥样硬化斑块破裂、形成新的血栓，导致冠脉再狭窄、再次心肌梗死等MACE事件发生，影响患者预后［9-10］。早期预测MACE 有助于合理制定临床治疗方案，降低患者病死率，延长患者生存时间。目前缺乏有效的MACE 预测机制，量表评估存在一定主观性，受评估者经验等主观因素影响较大，且缺乏影像学检查结果以及与患者预后密切相关的生物学指标，存在一定局限性。与心肌损伤相关的标志物，如肌酸激酶同工酶、C 反应蛋白、肌红蛋白等敏感度偏低。miRNA 是一类由20～25 个核苷酸组成的非编码单链RNA，参与细胞分化增殖、凋亡等多种病理生理过程，目前报道显示在高血压、心律失常、ACS等多种心血管疾病中均有特定循环miRNA 表达，其中超过50 种miRNA 在ACS 诊断方面具有较大临床价值［11］。

miR-186-5p 是miR-186 家族成员之一，具有调控细胞增殖、生长分化、迁移、平滑肌分化和收缩等作用，miR-186-5p表达异常，调控机制失衡与多种生理和病理过程相关［12-13］。miR-186-5p 在多种肿瘤中被发现具有癌基因和抑癌基因双重作用，在骨肉瘤细胞中miR-186-5p 表达下调，miR-186-5p 直接靶向叉头盒K1（FOXK1）3′-UTR 并负调控其表达，在肿瘤细胞增殖、肿瘤生长、侵袭和转移中发挥重要作用［14］。相反，miR-186-5p 在肺腺癌中呈高度表达，miR-186-5p直接靶向磷酸酶和tensin同源物（PTEN）促使肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭［15］。缺血脑卒中患者血清miR-186-5p 表达上调，miR-186-5p 高表达抑制神经系统发育的关键因子胰岛素样生长因子-1 表达，诱导神经元凋亡［16］。JIANG 等［17］报道指出miR-186-5p 在高糖诱导的心肌细胞表达下调，而给予miR-186-5p抑制剂可促使Caspase-3表达，降低心肌细胞生存能力，促进细胞凋亡，说明miR-186-5p在高糖诱导的心肌细胞损伤过程中发挥保护作用。目前miR-186-5p 在ACS 的相关报道较少，其在ACS发生发展中的作用机制尚不清楚。

本研究发现，ACS组术前miR-186-5p表达上调，高于对照组，SUN等［18］发现，动脉粥样硬化患者血清miR-186-5p 表达增高，且miR-186-5p 表达与颈总动脉内—中膜厚度呈正相关。说明miR-186-5p 参与动脉粥样硬化进程和ACS 发病。PCI 术后miR-186-5p 表达逐渐下调，呈时间依赖性降低，至术后2～7 d降至与对照组水平接近。通过随访发现，术前miR-186-5p 表达与ACS 患者MACE 有关，ROC 曲线分析术前miR-186-5p 表达在MACE 诊断中效能最高，AUC 达0.878，高于术后1～7 d，说明miR-186-5p 对ACS 患者PCI术后12个月内MACE 的发生具有较高预测价值，可作为PCI 治疗预后的预测因子。Ka‑plan-Meier 生存分析显示，miR-186-5p 高表达组MACE发生率高于miR-186-5p低表达组，多因素Cox风险回归分析结果表明，PCI 术前miR-186-5p 表达过高是导致ACS 患者MACE 的主要原因之一，验证了miR-186-5p 与ACS 患者术后MACE 的关系，但具体机制尚不清楚。可能机制：①血管内皮细胞功能障碍与心血管疾病发病密切相关，miR-186-5p 参与细胞损伤的调控，Y-linked 15 靶向miR-186-5p 调节缺氧诱导的细胞损伤，在缺氧诱导的内皮细胞损伤中miR-186-5p 表达上调可减轻缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞损伤［19］。②动脉粥样硬化是ACS 等心血管疾病的主要病理基础，miR-186-5p 是动脉粥样硬化的生物标志物，通过多种途径参与动脉粥样硬化进程。miR-186-5p 可通过PTEN/PI3K/Akt 通路调节氧化低密度脂蛋白参与动脉粥样硬化进程［20］，过表达miR-186-5p 可促进血管平滑肌细胞增殖迁移，诱导和促使动脉粥样硬化进程［18］。miR-186-5p还可通过E2F1/SNHG7/miR-186-5p/MMP2 轴调控内皮细胞增殖和迁移参与动脉粥样硬化进程［21］。总之，miR-186-5p 过表达加剧了冠脉粥样硬化进程，导致血栓形成和MACE事件发生。

本研究回归分析结果显示，术前Gensini评分是ACS 术后MACE 发生的危险因素之一，Gensini 评分是定量评估冠脉狭窄程度的指标，可全面反映冠脉病变累及范围和程度，是急性冠脉综合征患者发病后1～6个月MACE风险的独立预测因子［22］。

综上所述，ACS 患者PCI 术前miR-186-5p 呈高表达，miR-186-5p高表达与MACE 发生密切相关，可以为ACS患者预后评估提供参考。