血浆miR-30b-5p、EVLWI与急性呼吸窘迫综合征患者病情严重程度及预后的关系

龙威，曾雅军，陈颖

湖南中医药高等专科学校附属第一医院（湖南省直中医医院），湖南株洲412000

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是由肺毛细血管通透性增加导致的炎症性肺水肿，进而引起持续低氧血症和急性呼吸衰竭，是重症患者死亡的主要原因之一，据统计病死率达30%～60%［1］。微小RNA（miRNA）是一类细胞内源性小分子非编码RNA，通过转录后调控ARDS 炎症反应、免疫反应等多种病理生理过程，在ARDS 发病机制中发挥重要作用［2］。miR-30b-5p 属于miR-30b 家族成员，参与多种癌症发病机制。近期研究显示，miR-30b-5p 在急性肺损伤患者中表达异常［3］，提示miR-30b-5p 参与肺损伤发病。血管外肺水指数（EVLWI）是肺水肿特异性量化指标，反映肺泡、肺间质内液变化程度，EVLWI升高提示肺泡—毛细血管屏障功能障碍，血管外肺水集聚［4］。ARDS 是一种典型的非心源性肺水肿，EVLWI 在ARDS 患者中明显增高［5］。本研究拟探讨miR-30b-5p、EVLWI 与ARDS 病情严重程度和预后的关系，旨在为临床病情评估、预后判断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2019年12月我院重症监护病房（ICU）收治的172 例ARDS 患者（ARDS 组），纳入标准：①符合2012 年柏林新定义ARDS 诊断标准［6］；②ICU 住院时间＞72 h；③年龄18～80岁。排除标准：①心力衰竭或液体过负荷引起的呼吸衰竭；②心源性肺水肿、神经源性肺水肿；③合并肺结核、肺部肿瘤；④入院前接受激素治疗。男95 例，女77 例，年龄45～60（52.65 ± 3.71）岁，氧 合 指 数（PaO2/FiO2）114.92～311.9（219.21 ±83.13）mmHg。根据入院24 h 内评估PaO2/FiO2结果将其分为轻度组（PaO2/FiO2：201～300 mmHg，53例）、中度组（PaO2/FiO2：101～200 mmHg，71 例）、重度组（PaO2/FiO2：≤100 mmHg ，48 例）。本研究获得我院医学伦理委员会批准（2017-株-X0012），受试者或其家属均知情同意并签署同意书。

1.2 临床基线资料收集 搜集ARDS 患者年龄、性别、ARDS病因（创伤、脓毒症、肺栓塞、心肺复苏术后等）、生化指标［Bayer2400型（德国）全自动生化分析仪检测总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）］、血气指标［GEM Premier3000（美国）全自动床旁血气分析仪检测动脉氧分压（PaO2）、氧体积分数（FiO2）、动脉二氧化碳分压（PaCO2）、计算PaO2/FiO2］、顺序序贯器官衰竭评估（SOFA）评分、急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ（APACHE Ⅱ）评分。根据体温、平均动脉压、心率、呼吸、动脉血氧分压、pH、血钠、血钾等计算APACHE Ⅱ评分，总分0～71分［7］。根据PaO2/FiO2、呼吸支持、凝血、肝功能、肾功能、神经等计算SOFA评分，总分0～48分［8］。

1.3 血浆miR-30b-5p 检测 ARDS 组患者发病当日采集空腹静脉血5 mL，注入EDTA 抗凝管，4 ℃3 000 r/min 离心20 min（离心半径10 cm），分离血浆-80 ℃保存备用。室温复融血浆样本，采用TRIzol试剂（美国Ambio 公司）提取总RNA，采用CFX96 RT-PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）进行实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）将总RNA 转录为cDNA。反转录体系共18 μL，包括RNA 模板5 μL，1 μL Oli‑godT，反转录酶（50 U/μL）1 μL，RNA 酶抑制剂（20 U/μL）0.5 μL，dNTPs（100 mmol/L）1 μL，buffer液1.5 μL，DEPC 水5 μL，U6 及miRNA 引物3 μL。引物合成及序列测定由上海基康公司完成，序列如下：miR-30b-5p 正 向 引 物：5'-GGGCTGTAAA‑CATCCTACAC-3'，反 向 引 物：5'-TGCGTGTCGTG‑GAGTC-3'，U6 正向引物5'-CTCGCTTCG GCAGCA‑CA-3'，反 向 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应条件：95 ℃10 s，65 ℃20 s；75 ℃15 s，共40 个 循环。扩 增 条 件：95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃60 s，45 个循环，共3 次平行试验。2-ΔΔCt法计算miR-30b-5p 相对表达量。

1.4 EVLWI 检测 ARDS 组患者入住ICU 当日均经股动脉置入PiCCO 导管（德国Pulsion），右颈内静脉置入中心静脉导管，连接PHILIP Intelli Vue MP 50 监护仪和温度探头，于中心静脉置管处注入4 ℃的生理盐水15 mL，经肺热稀释法测定EVLWI。

1.5 预后观察 所有患者入院后行充分镇静、床旁心电监护、气管插管、呼吸机辅助通气，积极抗感染，抗休克等治疗。追踪入院28 d 内临床结局，根据死亡情况将其分为生存组（108 例）、死亡组（64 例）。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。正态分布计量资料以±s表示，采用单因素方差分析或独立样本t 检验；偏态分布计量资料以M（Q1，Q3）表示，比较采用秩和检验。病因、性别等计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。Spearman秩 相 关 分 析miR-30b-5p、EVLWI 与ARDS 分 级、APACHE Ⅱ评分、SOFA 评分间相关性。二元Lo‑gistic 回归分析ARDS 患者预后的相关因素。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-30b-5p、EV‑LWI 预测ARDS 患者预后的价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料、血浆miR-30b-5p 和EVLWI 水平比较 死亡组SOFA 评分、APACHE Ⅱ评分、血浆miR-30b-5p 表达、EVLWI 指数高于存活组（P 均＜0.05），PaO2/FiO2低于存活组（P＜0.05），死亡组与存活组年龄、性别、肺损伤原因、BUN、Scr、TP、Alb、PaO2、FiO2、PaCO2比较差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表1。

表1 两组基线资料和血浆miR-30b-5p、EVLWI水平情况

2.2 不同ARDS 分级患者血浆miR-30b-5p 和EVL‑WI水平比较 重度组血浆miR-30b-5p表达、EVLWI指数高于中度组和轻度组（P 均＜0.05），中度组血浆miR-30b-5p 表达、EVLWI 指数高于轻度组（P 均＜0.05），见表2。

2.3 血浆miR-30b-5p 和EVLWI 水平与APACHEⅡ评分、SOFA 评分、ARDS 分级相关性 Spearman 秩相关分析显示，ARDS 患者血浆miR-30b-5p 表达、EVLWI 指数与APACHE Ⅱ评分、SOFA 评分、ARDS分级均呈正相关（r 分别为0.502、0.498、0.573，0.568、0.623、0.619，P均＜0.05）。

2.4 影响ARDS 患者预后的Logistic 回归分析 以ARDS患者预后为因变量（1=存活，0=死亡），SOFA评分、APACHE Ⅱ评分、PaO2/FiO2、miR-30b-5p、EVLWI（均为连续性变量，未进行赋值）为自变量，建立二元Logistic 回归模型，校正年龄、性别混杂因素，最终高APACHE Ⅱ评分、高表达miR-30b-5p、高指数EVLWI是ARDS不良预后的危险因素（P均＜0.01）。见表3。

表2 不同ARDS分级患者血浆miR-30b-5p和EVLWI水平比较（ ± s）

表2 不同ARDS分级患者血浆miR-30b-5p和EVLWI水平比较（ ± s）

注：与轻度组相比，*P＜0.05；与中度组相比，△P＜0.05。

组别轻度组中度组重度组EVLWI（mL/kg）8.97±2.16 10.05±2.69*13.43±3.52*△14.657＜0.05 n 53 71 48 F P miR-30b-5p 0.82±0.06 1.25±0.35*2.01±0.44*△17.369＜0.05

表3 影响ARDS患者预后的Logistic回归分析

2.5 miR-30b-5p、EVLWI 水平对ARDS 患者预后的预测价值 ROC 曲线分析结果示，miR-30b-5p、EV‑LWI 预测ARDS 患者预后的最佳截断值（cut-off）为1.52、11.49 mL/kg，曲线下面积（AUC）为0.738、0.824，miR-30b-5p、EVLWI 联合预测效能大于单独预测（Z分别为2.956、2.148，P均＜0.05），见表4。

表4 miR-30b-5p、EVLWI、APACHE Ⅱ评分预测ARDS患者预后的效能

3 讨论

ARDS 是一种具有异质性的疾病，多种致病性因素可致肺损伤，引起非静压性血管外肺水肿、严重低氧血症和急性呼吸衰竭［9］。目前ARDS 缺乏有效的预防和救治措施，临床治疗以对症支持性治疗为主，尽管近年来ARDS 分子机制研究不断深入，通气策略不断改进，但其病死率仍居高不下［10］。开发与ARDS 有关的生物学标志物有助于早期诊断、指导治疗及预后预测。

miRNA 是一种小非编码RNA，通过与3'-UTR结合翻译方式参与靶基因的转录后调控），在调节细胞增殖、分化、凋亡、代谢和免疫等方面发挥重要作用［11-12］。现有研究表明，miRNA 参与ARDS 炎症反应、细胞凋亡、发病和病情进展，与患者预后密切相关［13］。miR-30b-5p 是一种肿瘤调节因子，在胶质瘤中miR-30b-5p 通过直接靶向异黏蛋白调节细胞增殖［14］，miR-30b-5p还可通过靶向同源异形盒A1抑制肠嗜铬细胞的生长和侵袭［15］，miR-30b-5p 在肺癌中发挥促癌基因作用，与肺癌总生存率显著相关［16］。ZHOU等［4］报道显示，miR-30b-5p参与急性肺损伤炎症反应，可能成为急性肺损伤治疗靶点。miR-30b-5p 在ARDS 的报道并不多见，本研究结果显示，AR‑DS 患者血浆miR-30b-5p 表达增高，miR-30b-5p 表达与ARDS 分级、APACHEⅡ评分、SOFA 评分均呈正相关，说明miR-30b-5p 参与了ARDS 发病和病情进展。进一步分析miR-30b-5p与ARDS 患者预后关系发现，高表达miR-30b-5p 是ARDS 近期预后不良的危险因素。miR-30b-5p 参与ARDS 发病和病情进展机制：炎症反应是ARDS 发病的主要病理基础之一，细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）通过负向调节脂多糖诱导的急性肺损伤调控酪氨酸激酶（JAK）/转录激活因子-3（STAT3）炎症信号通路，参与肺细胞炎症反应调节。SOCS3 缺乏可活化巨噬细胞，引起促炎细胞因子释放，加剧炎症反应，miR-30b-5p通过3'-UTR 直接靶向并抑制SOCS3 表达，过表达miR-30b-5p 可下调SOCS3 mRNA 表达，进而促使肺部急性炎症反应，导致肺炎性损伤［4］。

肺泡由上皮、间质和毛细血管组成，毛细血管外空间为血管外肺空间，肺泡和间质中液体称为血管外肺水，无论是心源性还是非心源性肺水肿，EVL‑WI 均可出现增高。现有研究显示，EVLWI 在呼吸衰竭合并脓毒症休克患者中明显增高，与PaO2/FiO2和预后有关［17］，EVLWI 与脓毒性休克患者并发急性肺损伤患者肺泡灌洗液中人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量呈正相关性［18］。ARDS 发生时肺泡内释放大量细胞因子，刺激巨噬细胞合成分泌炎症因子，激活中性粒细胞、成纤维细胞，导致肺泡上皮细胞坏死凋亡，内皮细胞功能失能，肺通透性增加，引起炎性细胞和蛋白液大量渗出，导致肺水肿和EVLWI增高。PiCCO 是检测EVLWI的有效方法，已在动物模型重复测量验证其检测准确性［19］，本研究采用PiCCO 技术检测ARDS 患者EVLWI，发现AR‑DS患者EVLWI指数随着ARDS分级的增加而升高，且与ARDS 分级、APACHE Ⅱ评分、SOFA 评分呈正相关，说明EVLWI 可反映ARDS 患者缺氧和病情严重程度。BHATTACHARJEE 等［20］报道显示，EVLWI与ARDS 患者氧合指数呈中度相关。本研究回归分析结果显示，高EVLWI 是ARDS 患者预后不良的危险因素，左智等［21］研究结果显示，EVLWI与ARDS患者SOFA评分有关，EVLWI可预测ARDS患者预后。

本研究ROC 曲线分析结果显示，miR-30b-5p、EVLWI 对ARDS 患 者 预 后 的AUC 分 别 达0.839、0.894，说明miR-30b-5p、EVLWI 在预测ARDS 预后方面有较高价值，联合miR-30b-5p、EVLWI 明显提高对ARDS 患者预后预测效能，提示临床对于高表达miR-30b-5p，高指数EVLWI 患者应高度警惕不良预后的发生。

综上所述，ARDS 患者血浆miR-30b-5p 表达增高，EVLWI 指数增加，高表达miR-30b-5p 和高指数EVLWI 与ARDS 持续低氧血症和不良预后相关，miR-30b-5p、EVLWI 可作为ARDS 预后评估的参考指标。