皮肌炎患者Th17细胞及其相关细胞因子的表达变化与意义

吴远慧，陈雷刚，杨亚慧，杨晓静，黄攀登，冯冬梅，杨金良，周向昭

河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000

皮肌炎是一种以肌肉无力为特点的自身免疫性疾病，主要累及横纹肌，可伴或不伴多种皮肤损害，亦可伴发各种内脏损害［1］。皮肌炎作为自身免疫性疾病，其发病与机体免疫系统调节失衡密切相关，而T 淋巴细胞介导的细胞免疫反应是机体重要的免疫调节机制［2-3］。辅助性T 细胞17（Th17）是在白细胞介素23（IL-23）诱导下由CD4+T 细胞的Th 细胞亚群合成和分泌的T 细胞亚群，可通过激活T 淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞而释放IL-17、IL-23 等细胞因子［4］。关于上述相关细胞因子在皮肌炎发病过程中的作用，目前相关研究证据尚不足。本研究主要探讨皮肌炎患者Th17 细胞及其相关细胞因子的表达变化与意义，为皮肌炎临床诊断及治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016 年6 月—2020 年6 月本院皮肤科收治的皮肌炎患者68例，均符合皮肌炎的诊断标准［7］：①患者皮肤出现明显皮疹；②肌肉活动可见肌肉呈病变性坏死；③肢带肌及颈前屈肌无力且伴有吞咽困难或呼吸肌无力；④实验室检验发现C 反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）、铁蛋白（FER）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）异常升高；⑤肌电图显示有肌源性损害。纳入标准：①年龄18～75 岁；②签署知情同意书；③未接受免疫抑制剂、糖皮质激素类药物治疗。排除标准：①恶性肿瘤；②可能影响本研究结果的其他急、慢性炎症反应性疾病；③合并其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮；④妊娠期或哺乳期。其中男38例，女30例；年龄22～67（42.5 ± 3.8）岁。于同期随机选取体检健康者60例为对照组，近3个月内均无外伤史、无手术史、未服用药物。其中男34 例，女26 例；年龄18～72（43.2 ± 3.9）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P 均＞0.05），具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 血清IL-17、IL-22、IL-23 及相关实验室指标检测 抽取两组清晨空腹肘静脉血5 mL，常温下静置30 min，3 000 r/min 离心10 min，离心半径10 cm，留取上清液，于-80 ℃冰箱中保存，留待检测。采用酶联免疫吸附法测定血清IL-17、IL-22、IL-23、CRP。IL-17、IL-22、CRP 试剂盒均由上海西唐生物科技有限公司提供，IL-23试剂盒由北京和杰创新生物医学科技有限公司提供，严格按照试剂盒说明进行操作。用贝克曼库尔特AU5800 全自动生化分析仪检测红细胞沉降率（ESR）、铁蛋白（FER）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）。

1.3 外周血Th17细胞检测 采用流式细胞术。抽取两组清晨空腹肘静脉血3 mL，置于EDTA-K2抗凝真空管，用Ficoll 淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞。用RPMI1640 稀释全血，加入佛波醇乙酯25 μL、离子霉素20 μL、布雷菲德霉素A 4 μL，37 ℃孵育5 h。设A 管（同型对照管）和B 管（检测管），每管分别加入CD3-PerCP 2.5 μL、CD8-FITC 2.5 μL，室温避光孵育15 min，加入破膜剂中的Re‑agent A 100 μL，室温避光15 min。清洗后每管加入Reagent B 100 μL。分别向A、B 管加入鼠IgG1-PE、IL-17-PE 2.5 μL，室温避光15 min，清洗后加500 μL PBS 重悬，上机检测，计算CD4+Foxp3+调节性T 细胞/CD4+T细胞、CD4+IL-17+/CD4+T细胞。

1.4 疾病活动度评价 参考文献［8］方法，采用肌炎疾病活动性评估视觉模拟量表（MYOACT）进行评价，包括一般情况、肌肉、心脏、肺脏、骨骼肌、胃肠道、皮肤黏膜等7 个系统及1 个疾病总活动评分，对应评分为0～4 分，MYOACT-总活动度评分为0～28分，分值越高提示患者疾病活动性越高。

1.5 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料采用±s表示，组间计量资料比较采用成组t检验，皮肌炎患者外周血Th17细胞及其相关细胞因子与MYOACT 及相关临床指标的关系采用Pearson积矩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血调节性T 细胞/Th17 细胞百分率比较 见表1。

表1 两组外周血调节性T细胞/Th17细胞百分率及相关细胞因子比较（ ± s）

表1 两组外周血调节性T细胞/Th17细胞百分率及相关细胞因子比较（ ± s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别皮肌炎组对照组IL-23（pg/mL）51.42±4.02*20.11±4.69 n 68 60 CD4+Foxp3+调节性T细胞/CD4+T细胞7.21±0.31*9.92±0.54 CD4+IL-17+/CD4+T细胞1.35±0.32*0.81±0.21 IL-17（pg/mL）77.25±6.14*28.96±5.02 IL-22（pg/mL）48.12±5.88*22.11±4.11

2.2 皮肌炎组与对照组MYOACT 活动度评分、CRP、ESR、FER、CK、LDH比较 见表2。

表2 皮肌炎组与对照组CRP、ESR、FER、CK、LDH比较（ ± s）

表2 皮肌炎组与对照组CRP、ESR、FER、CK、LDH比较（ ± s）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别皮肌炎组对照组LDH（U/L）402.52±38.52*157.25±10.55 n 68 60 CRP（mg/L）12.25±1.52*2.36±1.41 ESR（mm/h）36.58±3.98*6.71±1.11 FER（mg/mL）345.52±45.85*189.44±21.11 CK（U/L）378.52±46.98*45.88± 5.98

2.3 不同MYOACT 活动度评分亚组外周血调节性T 细胞/Th17 细胞百分率及相关细胞因子比较 皮肌炎组MYOACT 活动度评分为（7.62±1.55）分，按照MYOACT 活动度评分中位数7 分为界将皮肌炎组患者分为两个亚组，MYOACT 活动度评分＞7分者患者CD4+Foxp3+调节性T细胞/CD4+T细胞百分率低于≤7 分者，CD4+IL-17+/CD4+T 细胞百分率高于≤7 分者（P 均＜0.05）；MYOACT 活动度评分＞7 分者血清IL-17、IL-22、IL-23 水平均高于≤7 分者（P 均＜0.05），见表3。

表3 不同MYOACT 活动度评分亚组外周血调节性T细胞/Th17细胞百分率及相关细胞因子比较（ ± s）

表3 不同MYOACT 活动度评分亚组外周血调节性T细胞/Th17细胞百分率及相关细胞因子比较（ ± s）

注：与MYOACT活动度评分＞7分者相比，*P＜0.05。

研究对象MYOACT活动度评分≤7分者MYOACT活动度评分＞7分者IL-23（pg/mL）40.79±5.33*59.42±5.18 n 37 31 CD4+Foxp3+调节性T细胞/CD4+T细胞百分率8.56±1.24*5.38±1.12 CD4+IL-17+/CD4+T细胞百分率1.04±0.49*1.92±0.57 IL-17（pg/mL）43.89±8.15*85.60±8.47 IL-22（pg/mL）37.56±6.01*51.68±5.59

2.4 皮肌炎患者疾病活动度及临床指标与Th17细胞及其相关细胞因子的关系 Pearson 积矩相关性分析结果示，皮肌炎患者外周血CD4+Foxp3+调节性T 细胞/ CD4+T 细胞百分率与MYOACT 总活动度评分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈负相关（r 分别为-0.741、-0.698、-0.587、-0.772、-0.682、-0.655，P 均＜0.05），CD4+IL-17+/CD4+T 细胞百分率与MYO‑ACT 活动度评分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈正相关（r 分 别 为0.652、0.712、0.722、0.738、0.736、0.711，P 均＜0.05），IL-17 与MYOACT 活动度评分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈正相关（r分别为0.662、0.671、0.689、0.692、0.715、0.703，P 均＜0.05），IL-22 与MYOACT 活动度评分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈 正 相 关（r 分 别 为0.569、0.578、0.662、0.612、0.702、0.682，P 均＜0.05），IL-23 与MYOACT活动度评分、CRP、ESR、FER、CK、LDH 呈正相关（r 分 别 为0.498、0.562、0.485、0.668、0.691、0.775，P均＜0.05）。

3 讨论

皮肌炎典型临床表现有四肢关节伸面出现紫红色斑疹，对称性四肢近端肌肉进行性无力、骨骼肌呈现炎性细胞大量聚集浸润、肌电图肌源性改变等［9-10］。皮肌炎的发病机制尚未完全明确，可能与遗传、感染等因素有关，特别是感染所致的免疫调节功能紊乱贯穿皮肌炎发病整个过程［11］。

研究显示，在炎症因子刺激下，Th 细胞前体可分化为Th0 细胞，并进一步转化为调节性T 细胞及Th17 细胞，调节性T 细胞占外周血CD4+T 细胞数的5%～10%，其中Foxp3 是其天然的特异性标志，CD4+Foxp3+调节性T 细胞在IL-6 作用下可诱导生成Th17 细胞，并通过释放炎性细胞因子而参与自身免疫性疾病发病过程［12］。Th17细胞属于独特的CD4+T细胞亚群，主要对抗细胞外细菌以及霉菌的免疫反应，通过分泌IL-17、IL-22 等促炎因子而激活相关免疫细胞，最终导致机体出现自身免疫反应。研究显示，Th17 与CD4+T 细胞亚群之间存在复杂的网络调控，在介导炎症反应及免疫反应功能上相互拮抗，从而发挥抵抗外界感染及诱导自身免疫疾病等功能［13］。IL-17 是在T淋巴细胞诱导下由外周血CD4+Foxp3+调节性T 细胞产生的前炎症细胞因子，CD4+IL-17+与机体的抗感染及自身免疫调节密切相关，参与风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病发病过程［14］。IL-22 属IL-10 家族成员，是Th17 细胞合成并分泌的具有调节天然免疫和促进抗微生物防御等生物学功能的细胞因子。IL-23 是由活化的树突状细胞、单核细胞及巨噬细胞等产生的细胞因子，在机体炎性免疫以及体内IL-17产生过程中发挥作用，可促进T 细胞增殖，诱导记忆性T 细胞增殖。研究显示，细胞因子IL-17、IL-22、IL-23 与微环境中的炎性细胞因子相互作用，可刺激巨噬细胞等炎症细胞产生TGF-β并介导Th17细胞分化［15］。

本研究结果显示，皮肌炎患者外周血CD4+Foxp3+调节性T 细胞/ CD4+T 细胞百分率低于对照组，CD4+IL-17+/CD4+T 细胞百分率、IL-17、IL-22、IL-23 高于对照组，提示皮肌炎患者存在明显的免疫调节异常，其机制可能是Th17 与调节性T 细胞间可相互转化、相互抑制，Th17 细胞异常增加导致各亚群细胞失调，机体免疫功能紊乱，从而诱发皮肌炎［16］。血清CRP、ESR、FER、CK 是目前临床辅助诊断皮肌炎的常用指标。本研究结果显示，皮肌炎组CRP、ESR、FER、CK、LDH 高于对照组，说明皮肌炎的发生与机体炎症反应及免疫功能异常有关。

研究指出，皮肌炎患者血清CD4+IL-17+/CD4+T细胞百分率升高的患者更易发生肌肉组织坏死［18］。本研究发现，相较MYOACT活动度评分≤7分的皮肌炎患者，MYOACT 活动度评分＞7 分者外周血CD4+Foxp3+调节性T 细胞/ CD4+T细胞百分率更低，CD4+IL-17+/CD4+T 细胞百分率更高，而且炎性因子IL-17、IL-22、IL-23 水平升高。进一步研究结果显示，皮肌炎患者MYOACT 总活动度评分与外周血CD4+Foxp3+调节性T 细胞/CD4+T 细胞百分率呈负相关，而MYOACT 活动度评分与CD4+IL-17+/CD4+T 细胞百分率、IL-17、IL-22、IL-23 呈正相关。可能是因为炎症会导致肌肉细胞坏死或凋亡，从而引起T 淋巴细胞转录后修饰，而修饰后的T 淋巴细胞会刺激免疫系统产生抗体，因此可通过测定T 淋巴细胞及其相关细胞因子水平评价皮肌炎患者肌组织坏死情况［19］。皮肌炎患者CRP、ESR、FER、CK、LDH 与外周血CD4+Foxp3+调节性T细胞/CD4+T细胞百分率呈负相关，而CRP、ESR、FER、CK、LDH 与CD4+IL-17+/CD4+T 细胞百分率、IL-17、IL-22、IL-23 呈正相关，表明皮肌炎患者病情控制与Th17细胞及其相关因子调控有密切的关系。通过下调Th17细胞及其相关细胞因子表达能有效抑制皮肌炎患者强炎症反应，从而避免炎症因子攻击靶器官，引起患者相关并发症。

综上所述，Th17 细胞及其相关细胞因子的表达失衡可能与皮肌炎的发生有关，测定其水平可辅助临床评估患者病情进展。