应用TLC-CMS-IR 技术检测北芪菇中的L- 硒代蛋氨酸

杨卫民，姬紫薇，邓 钰，强 妍，林铧

（吕梁林果植物化学省市共建山西省重点实验室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，吕梁学院，山西吕梁 033001）

正北芪又称恒山黄芪，主要生长在富硒面积达74 km2的北岳恒山山脉。北芪菇为侧耳属平菇，是利用正北芪加工下脚料和多种中草药及农作物副产品作为培养料，经科学配方和特殊工艺培育而成的营养丰富、药用价值较高的新型菌类产品，具有补气固表、脱毒排脓、保护肝脏、强身健体、滋润皮肤、催生母乳等功能。

王润梅等人[1]采用了试管预试法和圆形滤纸层析法对北芪菇化学成分进行的系统研究表明，北芪菇中含有氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、多糖及其苷类、生物碱、黄酮及其苷类、酚性成分、植物甾醇、三萜成分、挥发油成分等。刘润平[2]指出北芪菇含有微量元素硒，其含量为0.54 mg/L。硒是谷胱甘肽过氧化酶等的必需组成部分，同时又是体内许多蛋白质的组成成分，对动物机体抗氧化、抗应激、提高免疫力等起着重要的作用[3]。植物体中的硒化合物通常具有较高的生理功能及较低的毒性，如硒蛋白和硒代氨基酸[4]。硒蛋白中的硒仅以硒代半胱氨酸（Selenocysteine，SeCys） 和硒代蛋氨酸 （Selenomethionine，SeMet） 2 种形式共价结合在蛋白质中。中科院药物所分析表明，正北芪含有β - 谷甾醇、亚油酸、亚麻酸、21 种氨基酸、D-B- 天冬素、胡萝卜甙、二十九烷、胆碱、多糖、微量元素硒等[5]。关于硒近年报道甚多，其防癌抗癌、抗衰老及提高人体免疫功能作用也是公认的。

关于硒的基础研究中，硒的无机物及有机化合物成为人们研究的热点，硒化合物含量分析也成为研究的必须手段。无机硒含量分析方法很多，诸如荧光法、X 射线荧光法、分光光度法、氰化物ICP法等[6-9]。但是，对硒代氨基酸的分析一直是研究者的难题之一，原因是同系物的其他氨基酸含量则要比硒代氨基酸含量高几千倍，造成严重干扰。以北芪菇为原料，用稀酸让蛋白质变性沉淀，酶解法分解蛋白质获得氨基酸，TLC 法提取制备硒代蛋氨酸，并用质谱仪、红外光谱仪、熔点仪和旋光仪对其进行表征分析。同时，对北芪菇菌粮和正北芪中硒代蛋氨酸进行了对比分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北芪菇、北芪菇菌粮和正北芪，山西省浑源县恒山北芪菇专业合作社提供。

乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、无水乙醇、石油醚、浓硫酸、硝酸、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙酸、水合茚三酮，均为分析纯；甲醇，分析纯和色谱纯；硅胶高效G 板；胰蛋白酶，CAS:9002-07-7，国药集团化学试剂有限公司提供；蛋白酶，CAS:39450-01-6，K FemibionGermany；L - 硒代蛋氨酸，CAS：3211-76-5，Aladddin 提供。

1.2 仪器与设备

DS-T250 型高速多功能粉碎机，上海顶帅工贸有限公司产品；THZ-82 型低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；KQ-100DE 型旋转蒸发器，昆山市超声仪器有限公司产品；ALB-224 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；XH-300B 型微波- 超声波组合合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司产品；KH-3000Plus 型薄层色谱仪，上海科哲生化科技有限公司产品；Expressions质谱仪和Plate ExpressTLS- 质谱接口，美国Advion公司产品；Tensor-11 型傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 硒代氨基酸的提取

（1） 样品的制备。将北芪菇粉碎，过筛80 目，称取0.5 g 各3 份置于4 mL 的离心管中，加入质量分数5%的硝酸溶液3 mL，立即盖上盖子剧烈振摇。

以转速12 000 r/min 离心5 min，去除上清液，用纯水洗涤2 次后保留沉淀物质备用。将沉淀物质转移至250 mL 锥形瓶中，加入Tris-HCl（0.5 mmol/L，pH 值 7.2） 30 mL，超声处理 5 min。

每隔12 h 依次加入胰蛋白酶（15 mg）、蛋白酶K（15 mg），在 37 ℃下振荡酶解 （转速为 100～180 r/min） 共36 h。酶解后，以转速4 000 r/min 离心10 min。

上清液用截留分子量为3 kD 的超滤离心，除去蛋白酶及大分子物质。用0.45 um 的滤膜抽滤，得到粗提液[10-12]。

（2） 标准品的制备。称取10 mg 的L- 硒代蛋氨酸于称量瓶中，加入适量的色谱甲醇溶解，定容至10 mL，得到质量浓度1 mg/mL 的L- 硒代蛋氨酸标准品溶液，置于2～4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 薄层层析分离纯化

（1） 点样。活化后用硅胶板冷却，用毛细管吸取L- 硒代蛋氨酸标准品溶液，在距底边2 cm 水平线上均匀点上合适的点数。每次加样后原点扩散直径不超过3 mm，干后再点一次[13]。待测品的点样方法与标准品的点样方法相同。

（2） 展开。配制正丁醇∶乙酸∶水= 7∶1∶2混合液作为硒代蛋氨酸的展开剂[8]，在展开缸饱和20 min，将已点样的硅胶板轻轻放入展开缸内，待到展开剂前沿距硅胶板顶端约1 cm 处时，取出薄层板晾干，备用。

（3） 薄层色谱成像。将晾干的薄层板放入薄层色谱成像系统，于波长365 nm 处紫外灯下拍照观察薄层板情况，并拍照记录。

（4） Rf值计算。观察已展开的L- 硒代蛋氨酸标准品和待测品薄层板位置一致的斑点，计算Rf值。

1.3.3 质谱仪检测

（1） 标准品的质谱检测。用色谱甲醇和超纯水作为流动相。将仪器和软件打开使其处于工作状态，用微量进样器吸取10 μL 的L - 硒代蛋氨酸标准品溶液插入到进样口处，打到Load 档开始进样，进完样后打回到Inject 档。点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

（2） 待测液的质谱检测。流动相与测标准品的流动相相同。使仪器和软件处于工作状态，将待测品薄层板置于TLC- 质谱接口上，使激光对准圈出的硒代蛋氨酸斑点中心处[14]。用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

1.3.4 红外光谱仪检测

（1） L- 硒代蛋氨酸标准品的检测。打开仪器，选择相应的工作界面，擦干净点样中心处，测试背景，再用毛细管吸取少量的标准品于点样中心处，测试样品，对谱图界面出现的谱图进行处理和分析。

（2） 待测品的检测。将薄层板上画出的硒代蛋氨酸斑点用小刀取下置于烧杯中，加入10 mL 谱甲醇，过滤。红外检测与标准品一致。

1.3.5 紫外含量测定

以甲醇作为参照，设置波长扫描范围为200～700 nm，对待测样液进行光谱扫描，得到紫外扫描图谱，读出最大吸收峰值。

将L - 硒代氨基酸标准品配置成0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL，检测并绘制标准曲线。1.3.6 比旋光度和熔点检测取待测样液分别进行旋光度、比旋光度的测量。将待测样液蒸发结晶，进行熔点的测量。（注：北芪菇菌粮和正北芪也进行了同样的处理。）

2 结果与分析

2.1 薄层层析成像与分析

L- 硒代蛋氨酸标准品TLC 图像见图1，北芪菇样液显色前TLC 图像见图2，北芪菇样液显色后TLC 图像见图3。

图1 L- 硒代蛋氨酸标准品TLC 图像

图2 北芪菇样液显色前TLC 图像

图3 北芪菇样液显色后TLC 图像

经过优化试验条件，最终确定所有图谱的展开剂均为正丁醇∶乙酸∶水（7∶1∶2，V/V）。

图1 和图3 是L - 硒代蛋基酸和北芪菇样液显色后的图像，图2 是北芪菇样液显色前的图像。均用型号为TLC Silica gel 60 F254（5 cm×7.5 cm） 的薄层板展开。

将图1、图2 和图3 进行比对可以发现，横线所标注的斑点几乎处于同一位置。经计算图1 所标注斑点的Rf值为0.368，图2、3 所标注斑点的Rf值为0.386，由此初步认为图中所标注的斑点为同一物质，可能均为硒代蛋氨酸。

北芪菇、北芪菇菌粮、正北芪显色前TLC 图见图4，L- 硒代蛋氨酸标准品显色后TLC 图见图5。

图4 北芪菇、北芪菇菌粮、正北芪显色前TLC 图

图5 L- 硒代蛋氨酸标准品显色后TLC 图

图4 和图5 均使用了硅胶板为GF254。经观察发现，图4 中北芪菇和正北芪样液在相同位置处具有一样的斑点，与图5 中经显色的L - 硒代蛋氨酸标准品斑点对比几乎处于同一位置。

经计算图4 所标注斑点的Rf值为0.587 和0.575，图5 中L- 硒代蛋氨酸标准品斑点的Rf值为0.588。初步认为北芪菇和正北芪样液中均含有硒代蛋氨酸。

需要进行表征来确定。

综上所述，由图1 到图5 中Rf值大小可以看出，其一由于图1，图2 和图3，图4 和图5 使用了不同的硅胶薄层版，其Rf值大小有差异属于正常情况；其二是使用相同的硅胶薄层版，其Rf值大小有细微的差异，也属于正常，因为可能与板的质量、展开剂的展开时间和室内温度都密切相关。但是需要作进一步的表征分析。

由图4 可知，同时检测的北芪菇菌粮中发现硒代氨基酸。

2.2 质谱检测与表征

2.2.1 北芪菇质谱检测与表征

L- 硒代蛋氨酸标准品质谱图见图6。

图6 L- 硒代蛋氨酸标准品质谱图

所有质谱图都是用ESI 离子源测得，并且离子模式为双离子模式。图6 为L - 硒代蛋氨酸标准品的质谱图，查阅参考文献可知L - 硒代蛋氨酸的结构式为，相对分子质量为196.6。在图谱中基峰的质荷比为195.9 m/z，因为硒代蛋氨酸含有氨基和羧基2 个官能团，在高温轰击状态下-COOH 中很容易失去氢离子，因此图谱中基峰的质荷比值比相对分子质量低1。

北芪菇提取液质谱图见图7，北芪菇提取液质谱图见图8。

图7 北芪菇提取液质谱图

图7 和图8 所选取的背景时间段相同，但所截取的测量时间段不同，如果2 幅图片的峰值相同更能进一步证明该种物质结构是电击轰离后的结构，而不是偶然所得。

图7 和图8 中出现的基峰质荷比分别为195.9 m/z和160 m/z 与L- 硒代蛋氨酸的标准品图谱的基峰对比发现图谱中的基峰相同，由此初步认为这些峰值为硒代蛋氨酸的峰值，其他的峰值有可能为经过其他反应所得到物质的峰，也可能为杂质的峰。

图8 北芪菇提取液质谱图

2.2.2 北芪菇菌粮质谱检测与表征

北芪菇菌粮提取液质谱图见图9，北芪菇菌粮提取液质谱图见图10。

图9 北芪菇菌粮提取液质谱图

图10 北芪菇菌粮提取液质谱图

图9 和图10 也是所选取的背景时间段相同，但所截取的测量时间段不同，如果2 幅图片的峰值相同，更能进一步证明该种物质结构是电击轰离后的结构，而不是偶然所得。

从图9 和图10 可以看出，这两幅图谱的峰较多且杂，从400 m/z 到700 m/z 不等，与标准品图谱对比发现这两图谱没有196 m/z 左右的峰值，所以认为没有检测到硒代氨基酸，这与薄层检测所得出的结果也一致。

2.2.3 正北芪质谱检测与表征

正北芪提取液质谱图见图11，正北芪提取液质谱图见图12。

图11 正北芪提取液质谱图

图11 和图12 均是也是所选取的背景时间段相同，但所截取的测量时间段不同，如果2 幅图片的峰值相同更能进一步证明该种物质结构是电击轰离后的结构，而不是偶然所得。

图11 和图12 均是正北芪提取液的质谱图。与标准品质谱图对比含有196 m/z 左右的峰值，初步认为这段峰值为硒代蛋氨酸的峰值。

综上所述，通过质谱检测与分析，北芪菇和正北芪样液中均含与L - 蛋氨酸的质谱基线峰值，但仅此判断它们就是L - 蛋氨酸还不够，需要进一步通过红外检测其官能团，以确定北芪菇和正北芪样液中硒代蛋氨酸。

2.3 红外检测与表征

L - 硒代蛋氨酸标准品（固体） 红外检测图见图13。

图13 L- 硒代蛋氨酸标准品（固体)红外检测图

由图13 可知，在2 800～3 000 cm-1范围内只有1 个比较明显的吸收峰，而在600～1 600 cm-1的范围内有许多比较明显的吸收峰。根据硒代蛋氨酸的分子结构式可知其特征峰应为羧基、氨基和硒所显示的峰值，查阅有关文献可知，饱和C-H 键的吸收峰值位于2 800～3 000 cm-1；羧酸中C=O 伸缩吸收的峰值位于1 706～1 720 cm-1，C-O 伸缩吸收的峰值位于1 210～1 320 cm-1，O-H 伸缩吸收峰值位于2 500～3 300 cm-1，并且峰形宽而强；氨基中N-H 伸缩振动吸收的峰值位于3 100～3 500 cm-1，C－N 伸缩振动的峰值位于1 000～1 350 cm-1，N-H 变形振动吸收峰值位于1 560～1 640 cm-1，C-Se 键吸收峰值位于700 cm-1左右。

将这些特征峰的吸收峰值范围与图13 进行对比，发现在697 cm-1处有吸收峰，初步判断含有C-Se 键，在2 918 cm-1处有个明显的吸收峰，可初步判断为C-H 键的伸缩振动引起，在1 219 cm-1有明显的吸收峰可初步判断为羧酸中的C-O 键，在1 344 cm-1处有吸收峰初步判断为氨基中的C-N 键，在1 566 cm-1处有吸收峰初步判断为氨基中的N-H键；除此之外，位于1 604 cm-1处的吸收峰可能为C-H 键弯曲振动引起，以上所述峰值为硒代蛋氨酸的特征峰值。

L- 硒代氨基酸（液态） 标准品红外图见图14。

图14 L- 硒代氨基酸(液态)标准品红外图

图14 是L- 硒代蛋氨酸标准品液体的红外图谱，溶剂为色谱甲醇，因此与固体标准品图谱相比有较大的差异，在3 200～3 400 cm-1范围内有个很宽的吸收峰，查阅有关资料判断为-OH 峰。在1 645 cm-1处有较明显的吸收峰，可判断为由N－H 变形振动引起，在1 014 cm-1处的吸收峰可判断为C-N 键伸缩振动引起。

北芪菇L - 硒代氨基酸红外图见图15，正北芪提取液红外图见图16，北芪菇菌粮提取液红外图见图17。

图15、图16 和图17 分别为北芪菇、正北芪和北芪菇菌粮样液红外扫描图。将3 幅图谱与L - 硒代氨基酸液体标准品图谱和固体标准品图谱进行对比发现，整个图谱的走势大致相同，但是图15、图16 和图14 的特征吸收峰大致相似，在1 640，1 340，1 030，700 cm-1左右都有吸收峰，由此可确定北芪菇和正北芪中含有L- 硒代蛋氨酸。

图15 北芪菇L- 硒代氨基酸红外图

图16 正北芪提取液红外图

图17 北芪菇菌粮提取液红外图

图17 北芪菇菌粮样液红外扫描图，没有相似的吸收峰。

2.4 紫外检测与分析

L- 硒代蛋氨酸标准品紫外扫描图见图18。

图18 L- 硒代蛋氨酸标准品紫外扫描图

由图18 可知，L- 硒代蛋氨酸标准品在214 nm处有最大吸收峰，查阅文献可知L - 硒代蛋氨酸在220 nm 左右有最大吸收峰，所测结果与其相符。

L- 硒代蛋氨酸标准品检测结果见表1，样品紫外检测结果见表2。

表1 L- 硒代蛋氨酸标准品检测结果

表2 样品紫外检测结果

按表1 设置质量浓度梯度，经标准品质量浓度梯度测量得到一条标准曲线。

L- 硒代蛋氨酸标准品标准曲线图见图19。

图19 L- 硒代蛋氨酸标准品标准曲线图

由表2 可知，L - 硒代蛋氨酸质量浓度分别为0.04，0.07 mg/mL，经计算北芪菇中硒代蛋氨酸的含量为0.24%，正北芪中硒代蛋氨酸含量为0.42%。

2.5 比旋度、旋光度和熔点测定

L- 硒代蛋氨酸标准品的旋光度见表3，北芪菇L- 硒代蛋氨酸的旋光度见表4，正北芪L- 硒代蛋氨酸的旋光度见表5。

表3 L- 硒代蛋氨酸标准品的旋光度

表4 北芪菇L- 硒代蛋氨酸的旋光度

表5 正北芪L- 硒代蛋氨酸的旋光度

由表3、表4 和表5 可知，L- 硒代蛋氨酸标准品、北芪菇和正北芪提取液的比旋光度分别为18.05，18.39，18.25；旋光度分别为 18.80，18.34，18.67。出现差异的原因可能与手动刮板、硅胶板质量以及杂质干扰相关。

经测量北芪菇提取液的结晶熔点分别为268，265，266，平均值约为266；正北芪提取液的结晶熔点分别为266，265，266，平均值约为266；L - 硒代蛋氨酸标准品的结晶熔点为265，267，267，平均值约为266。

3 结论

以北芪菇、北芪菇菌粮和正北芪为原料，稀硝酸使蛋白质沉淀变性，用胰蛋白酶（15 mg） 和蛋白酶K（15 mg） 分解蛋白质，分解时间36 h，离心过滤获得待测样液。

展开（正丁醇∶乙酸∶水（7∶1∶2，V/V）） 和显色后，北芪菇和正北芪浸提液紫色斑点中有1 个与硒代蛋氨酸标准品斑点位置一致，其Rf值为0.368；北芪菇菌粮中未见清晰斑点。

质谱检测显示，北芪菇和正北芪样液和硒代蛋氨酸标准品基峰质荷比（m/z） 均为196 m/z；红外光谱分析显示，北芪菇和正北芪样液和硒代蛋氨酸标准品均含有N-H、O-H、C-O、C-N、C-Se 等功能团；北芪菇和正北芪样液中硒代蛋氨酸含量分别为0.24%和0.42%。

北芪菇和正北芪提取液L - 硒代蛋氨酸标准品的结晶熔点均为266；L- 硒代蛋氨酸标准品、北芪菇和正北芪提取液的比旋光度分别为18.05，18.39，18.25；旋光度分别为18.80，18.34，18.67。

质谱法是一种鉴定这些斑点的强大技术，然而传统的从薄层板上手动刮点、萃取、重组，进而在质谱上注射分析获取质谱图的过程耗时耗力。Plate Express TM 是一种直接从TLC 薄层板上获取质谱图，提供简单、自动化方法的设备，使用这项技术甚至可以不经过样品前处理，快速在复杂混合物中鉴定出产品。