黑苦荞胶囊对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用

葛瑞宏，李鹏冲，王 永，王法云，王 慧

（1. 上海交通大学医学院公共卫生学院，上海市转化医学协同创新中心- 食品安全与毒理学评价中心，上海 200025；2. 河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州 450002；3. 上海海洋大学食品学院，上海 201306）

糖尿病是由于胰岛素分泌不足或机体抵抗胰岛素作用而引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，是威胁人类健康的慢性疾病之一[1]。随着经济的发展和人们生活水平的提高，高糖高脂日常饮食加之各种因素的共同作用使得糖尿病患病人数逐年增加。据2013 年中国慢性疾病监测数据，18 岁及以上人群糖尿病患病率高达10.4%[2]。2014 年世界卫生组织统计，全世界约8.5%的人口患有糖尿病，即有4.22 亿糖尿病患者[3]。持续性高血糖可引起血管损害、功能和代谢障碍，产生多种并发症，防治糖尿病已刻不容缓。

苦荞（Fagopyrum tataricum（L.） Gaerth.），又称鞑靼苦荞，是蓼科（Polygobaceae） 荞麦属（Fagopyrum） 一年生草本双子叶植物[4]。近年来，苦荞由于其独特的营养价值和突出的医药保健功能引起国内外农业、食品营养及医学界专家学者的广泛关注和研究兴趣[5-8]。苦荞不仅营养成分丰富，还含有多种生物活性成分[9]。芦丁及其衍生物具有重要的药理学活性，是苦荞降血糖功效成分[10]。苦荞根据品种的不同分为黑苦荞和黄苦荞，黑苦荞中芦丁含量是黄苦荞的3～5 倍[11]。试验以基于黑苦荞黄酮的胶囊产品为研究对象，通过其对四氧嘧啶所致高血糖小鼠的降血糖作用，评价其降血糖功能，为黑苦荞保健食品开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试黑苦荞胶囊样品由实验室研制[12]：以黑苦荞为原料，采用超声波辅助乙醇回流提取黄酮成分，经真空浓缩、真空干燥得苦荞黄酮粉，按适当比例添加微晶纤维素、硬脂酸镁等辅料，再经制粒、过筛和灌装得黑苦荞胶囊。相同工艺条件下制备3 批次样品用于动物试验，产品批号为20180831，20180903，20180905，置阴凉干燥处保存。

1.2 试验动物

健康SPF 级昆明小鼠26±2 g 90 只，雄性，试验动物生产许可证号：SCXK（沪） 2018-0004，合格证号：No.311620400017897；动物维持饲料生产许可证号：苏饲证（2017） 05005，上海杰思捷实验动物有限公司提供；屏障动物房试验条件：温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。

1.3 仪器与试剂

四氧嘧啶 （C4H2N2O4·H2O），美国 Sigma 公司产品；Freestyle Freedom Lite 血糖仪、血糖试纸（葡萄糖脱氢酶法），雅培贸易（上海） 有限公司产品；UW820S 型电子天平，岛津国际贸易（上海） 有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 体重测定

采用电子天平进行试验小鼠体重称量，每次称量前禁食4 h（不禁水）。

1.4.2 动物分组

购入雄性昆明小鼠90 只，适应1 d 后，禁食4 h（自由饮水）。称量体重，取尾静脉血测定其空腹血糖值作为该批次动物基础血糖值。随机分为正常组和模型组两大组。其中，正常组动物30 只，每组15 只，标记为正常空白组和正常高剂量组；模型组动物60 只，造模成功后按血糖水平再随机分为模型对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，以实际造模成功的动物数量记录试验结果，每组动物数量不低于10 只。

1.4.3 剂量选择与受试物给予方式

根据受试样品人体推荐摄入量2.7 g / 人/ 日（按60 kg 体重计），设低剂量0.225 g/kg·bw/d，中剂量 0.45 g/kg·bw/d，高剂量 1.35 g/kg·bw/d 3 个剂量组（分别相当于人体推荐摄入量的5 倍，10 倍，30 倍），同时设模型对照组（0 g/kg·bw/d），另设正常动物的受试样品组（高剂量1.35 g/kg·bw/d） 和空白对照组（0 g/kg·bw/d）。受试样品（黑苦荞胶囊内容物） 用蒸馏水配制，低、中、高剂量组配制质量浓度分别为45，90，270 mg/mL，空白对照组 （0 g/kg·bw/d） 及模型对照组（0 g/kg·bw/d） 以蒸馏水代替受试物，经口每日1 次给予小鼠相应质量浓度的受试样品，小鼠灌胃量为5 mL/kg·bw，连续灌胃30 d，每周称1 次小鼠体重调整灌胃量。第31 天禁食4 h 后测空腹血糖。

1.4.4 高血糖模型动物造模方法

模型组动物禁食24 h（自由饮水），用低温下4 ℃无菌生理盐水配制的13 mg/mL 四氧嘧啶以1 mL/100 g·bw 腹腔注射造模。饲养 5～7 d 后小鼠禁食4 h 进行血糖值的测定，血糖值达10～25 mmol/L即为高血糖模型造模成功的动物[13]。

1.4.5 糖尿病模型动物降血糖试验

试验前按照1.4.2 对高血糖模型小鼠进行随机分组。各剂量组依据小鼠体重及灌胃量要求给予黑苦荞降血糖胶囊受试物，连续灌胃30 d，每周测1 次体重，根据体重调整灌胃量。模型对照组灌胃相应溶剂。试验结束，进行空腹血糖值的测定。血糖下降率计算公式如下[13]：

1.4.6 糖尿病模型动物糖耐量试验

首先，对各剂量组动物进行空腹血糖值的测定，记录0 h 血糖值；各剂量组灌胃不同浓度的黑苦荞降血糖胶囊，模型对照组灌胃相同体积的溶剂，20 min后按照2.0 g/kg·bw 灌胃葡萄糖溶液，记录时间，分别在0.5，2 h 后测定血糖值，计算血糖曲线下面积，计算公式如下[14-15]：

正常组动物糖耐量试验与1.4.6 相同。

1.5 试验数据统计

采用Excel 2010 和GraphPad Prism 8.0 软件进行数据统计分析。所有试验数据均采用平均值±标准偏差 （SD） 表示。

1.6 结果判定

依据“关于印发抗氧化功能评价方法等9 个保健功能评价方法的通知（国食药监保化[2012]107 号）”中“辅助降血糖功能评价方法”进行结果判定[13]。

2 结果与分析

2.1 黑苦荞胶囊对正常小鼠体重的影响

黑苦荞胶囊对正常小鼠体重的影响见表1。

表1 黑苦荞胶囊对正常小鼠体重的影响（X±s）

由表1 可知，与灌胃溶剂的空白组相比，正常组小鼠灌胃高剂量黑苦荞胶囊后其体重在试验初始（0 d）、中期 （15 d） 和后期 （30 d） 未出现明显差异 （p＞0.05）。

2.2 黑苦荞胶囊对正常小鼠空腹血糖的影响

黑苦荞胶囊对正常小鼠空腹血糖的影响见表2。

表2 黑苦荞胶囊对正常小鼠空腹血糖的影响（X±s）

由表2 可知，与正常空白组相比，正常组小鼠高剂量灌胃受试物后，试验初始（0 d）、中期（15 d） 和后期（30 d） 的空腹血糖值未出现明显差异 （p＞0.05）。

2.3 黑苦荞胶囊对正常小鼠糖耐量的影响

黑苦荞胶囊对正常小鼠糖耐量的影响见表3。

表3 黑苦荞胶囊对正常小鼠糖耐量的影响（X±s）

由表3 可知，正常高剂量组与正常空白组相比，糖耐量无明显差异（p＞0.05）。

2.4 黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠体重的影响

黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠体重的影响见表4。

表4 黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠体重的影响（X±s）

由表4 可知，与高血糖模型对照组相比，各剂量组小鼠体重在试验初始（0 d）、中期（15 d） 和后期 （30 d） 未出现明显差异 （p＞0. 05）。

2.5 黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响

黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响见表5。

表5 黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响（X±s）

由表5 可知，经口给予高血糖模型小鼠低、中、高不同剂量的黑苦荞胶囊，连续30 d 后对各组动物的空腹血糖值进行测定。结果显示，与未灌胃受试物的模型对照组比较，不同剂量组小鼠空腹血糖值均显著下降 （p＜0.05）。

2.6 黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠糖耐量的影响

黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠糖耐量的影响见表6。

由表6 可知，与模型对照组比较，中剂量小鼠血糖曲线下面积显著降低（p＜0.05），低剂量小鼠血糖曲线下面积降低极显著（p＜0.01）。

表6 黑苦荞胶囊对高血糖模型小鼠糖耐量的影响（X±s）

3 结论

试验采用CFDA 于2012 年发布的有关保健食品功能评价方法（国食药监保化[2012]107 号），其对“辅助降血糖功能评价方法”结果判定做出规定，要求2 项检测指标空腹血糖、糖耐量中至少一项呈现阳性，同时对于血糖正常动物的空腹血糖值没有任何不良影响，才可判定该受试物具有辅助降血糖功能。试验数据结果显示，血糖正常组动物灌胃黑苦荞胶囊后体重、空腹血糖未出现任何异常现象，与糖尿病模型对照组比较，灌胃不同剂量黑苦荞胶囊小鼠的血糖下降率明显增加（p＜0.05）。糖耐量试验中，低剂量组和中剂量组小鼠血糖曲线下面积显著降低（p＜0.01，p＜0.05）。由此可以判定，黑苦荞胶囊辅助降血糖功能动物试验结果为阳性。

4 讨论

现有研究结果表明，苦荞降血糖作用主要是通过抑制ɑ - 葡萄糖苷酶、改善胰岛素抵抗、调节磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt） 信号通路等实现的[16]。ɑ - 葡萄糖苷酶抑制剂作用原理为苦荞活性成分对消化道内的ɑ - 葡萄糖苷酶产生了抑制作用，降低了淀粉的分解速度，使得葡萄糖浓度降低，减缓消化道对其吸收，降低餐后血糖值。目前，因其独特的优势已被广泛应用于临床糖尿病治疗中。Calzada F 等人[17]研究结果表明，芦丁能够改善糖尿病患者的胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱，促进人体内的胰岛素分泌，提高胰岛素受体亲和力，具有显著降血糖功能。晚期糖基化终产物（Advanced Glycation Endproducts AGEs） 被认为是由还原糖类与体内其他营养成分的氨基部分发生非酶促反应后形成的物质，含量过高就有可能致病。AGEs 与糖尿病等慢性疾病密切相关，糖尿病患者组织中的AGEs 含量较高[18]。Lee C C 等人[19]研究发现，苦荞醇提物和芦丁能够通过抑制果糖胺和α - 二羰基化合物降低AGEs的产生。同时，还发现苦荞醇提物、芦丁和槲皮素能够通过促进Akt 磷酸化作用并激活PPARγ 改善肝细胞葡萄糖摄取[20]。此外，苦荞提取物在保护肝细胞蛋白磷酸化有胰岛素类似物的作用。芦丁被发现还能够通过刺激大鼠胰腺β 细胞中胰岛素受体底物- 2 信号通路缓解β 细胞糖毒性。因此，芦丁在维持Ⅱ型糖尿病人胰岛素信号传导方面具有内在保护作用。

中国是荞麦主产国，据FAO 统计，2017 年世界荞麦种植面积394 万hm2，总产量383 万t。其中，中国荞麦种植面积168 万hm2，总产量145 万t，占世界荞麦总种植面积和总产量的42.7%，37.8%，分居第一、第二位，苦荞资源得天独厚。同时，中国也是糖尿病患者最多的国家之一，开发苦荞降血糖保健食品不仅能够更好地利用我国现有天然降血糖资源，对健康产业发展也具有一定的意义。