外周血Th1、Th17细胞比值与布氏杆菌性脊柱炎术后复发的相关性

贾永利，杨新明，张培楠，孟宪勇，胡长波

布氏杆菌性脊柱炎是由布氏杆菌侵袭脊柱引发椎体或椎间盘炎性反应改变的一种感染性疾病[1]。临床病理特征为肉芽肿性炎[2]。其最先累及软骨组织，继而累及椎间盘，引起骨质破坏和椎间盘形态改变，最终导致椎间盘发生功能及形态的改变[3]。布氏杆菌性脊柱炎的发病机制尚不明确，但有研究发现，机体免疫功能可能与脊柱炎的发生发展密切相关；CD4+T细胞包括Th1细胞、Th17细胞等，是机体免疫应答的重要部分[4]。Th17细胞是产生白介素-17(IL-17)等细胞因子的辅助性T细胞，IL-17可诱导炎性细胞因子产生并导致组织器官发生炎性损伤和组织损伤[5]。目前，Th1、Th17细胞在布氏杆菌性脊柱炎中的作用尚不清楚。现分析布氏杆菌性脊柱炎患者外周血中Th1、Th17细胞比值水平，并从免疫学角度为布氏杆菌性脊柱炎发病机制及临床诊断提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2020年3月河北北方学院附属第一医院骨外科收治布氏杆菌性脊柱炎患者68例作为研究对象(脊柱炎组)，男44例，女24例，年龄42～70(56.94±7.78)岁；病程3～26(6.18±1.14)个月；感染原因：因饲养、放牧而受污染30例，接触病畜的尿粪及其污染物15例，饮用未经消毒乳制品或吃生羊肉11例，处理病畜生产而受污染8例，屠宰病畜或分离内脏而受污染4例；发病部位：1个椎体受累8例，2个椎体受累37例，3个椎体受累23例；病灶部位腰椎多于胸椎。选取同期医院体检健康者70例为健康对照组，男44例，女26例，年龄42～70(57.64±8.28)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院伦理委员会批准，研究对象知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①以腰腿痛为主要症状就诊；②磁共振成像检查发现脊柱存在感染性病变；③经血清学或病理活检，确诊感染菌为布氏杆菌；④病例资料齐全，术后同意接受随访。(2)排除标准：①近6个月使用糖皮质激素等激素类药物；②合并其他类型自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎等)；③妊娠期或哺乳期女性；④合并慢性炎性反应疾病；⑤合并严重肝、肾功能异常。(3)布氏杆菌感染诊断标准[6]：①有明确的流行病学接触史(如家畜、野生动物)；②实验室虎红平板凝集实验结果为阳性；③细菌学培养结果为阳性。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 Th1和Th17细胞百分比率检测：患者于术前及术后3 d、体检者当日清晨空腹采集肘静脉血5～6 ml，平均分成2份，一份置于普通采血管中，4℃离心留取上清，冻存于-80℃冰箱中，待测；另一份置于含乙二胺四酸二钾采血管中，-80℃冰箱保存。上述直接冻存的静脉血解冻，离心分离出上层血浆，向试管中加入等体积的PBS稀释液，再加入淋巴细胞分离液，继续梯度离心，获取外周血单核细胞。加入藻红蛋白(PE)标记的CD8单抗20 μl和PE-Cy5标记的CD3单抗10 μl，4℃避光孵育20 min，加入溶血素1 ml，室温静置15 min，离心弃上清后，PBS清洗1次。加入破膜剂500 μl，离心弃上清后进行胞内细胞因子染色;然后加入IFN-γ(FITC标记)抗体和IL-17A(FITC标记)进行胞浆染色，4℃避光温育20 min，PBS清洗1次，重悬细胞，置于Accurl C6型流式细胞仪(美国BD公司)中检测分析Th1、Th17细胞比例，CD3+CD8-IFN-γ+即为Th1细胞，CD3+CD8-IL-17+即为Th17细胞。

1.3.2 血清炎性因子检测：取上述冻存血清解冻。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-23、IL-6；IL-2、IL-6 ELISA试剂盒购自(上海晶抗生物工程有限公司)，IFN-γ ELISA试剂盒购自(上海广锐生物科技有限公司)，IL-17 ELISA试剂盒购自(北京百奥莱博科技有限公司)，IL-23 ELISA试剂盒购自(南京赛泓瑞生物科技有限公司)。均严格参照操作说明书进行。

1.3.3 随访：术后对布氏杆菌性脊柱炎患者随访3个月，根据患者恢复情况分为未复发亚组60例和复发亚组8例。

2 结 果

2.1 2组术前外周血单核细胞Th1、Th17细胞百分率比较 与健康对照组比较，脊柱炎组患者外周血单核细胞Th17细胞比例升高，Th1细胞比例降低(P均<0.01)，见表1。

表1 2组术前外周血单核细胞Th1、Th17细胞比较

2.2 2组术前血清炎性因子比较 与健康对照组比较，脊柱炎组患者血清IL-17、IL-6、IL-23水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低(P均<0.01)，见表2。

表2 2组术前血清炎性因子水平比较

2.3 脊柱炎患者2亚组外周血单核细胞Th1、Th17细胞百分率比较 与未复发亚组比较，复发亚组患者术后外周血单核细胞Th17细胞比例升高，Th1细胞比例降低(P均<0.01)，见表3。

表3 术后2亚组外周血单核细胞Th1、Th17细胞比较

2.4 脊柱炎患者2亚组血清炎性因子水平比较 与未复发亚组比较，复发亚组患者术后血清IL-17、IL-6、IL-23水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低(P均<0.01)，见表4。

表4 术后2亚组血清炎性因子水平比较

2.5 影响布氏杆菌性脊柱炎术后复发因素分析 以布氏杆菌性脊柱炎术后是否复发为因变量，术后Th1细胞百分比、Th17细胞百分比、IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ为自变量，多因素Logistic回归分析显示，术后Th1、Th17细胞百分比及IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ均是布氏杆菌性脊柱炎术后复发的危险因素，见表5。

表5 多因素Logistic回归分析影响布氏杆菌性脊柱炎术后复发因素

3 讨 论

布氏杆菌病是人畜共患的地区性流行病，属于乙类传染病。人类患病的主要原因是与携带或感染布氏杆菌的牛、猪、羊等牲畜有接触，主要通过呼吸道、皮肤及消化道途径进入人体，寄生在人血液中，会引发人体发热及多器官损伤，如骨骼肌、肝脏、脾脏等，但对脊柱的损伤最为常见[7-8]。正常人脊柱布氏杆菌感染的几率为2%～77%，多发生在50岁左右的人群中，尤其以男性患病居多，且与患者职业相关性较大[9]。本病以腰背疼痛为常见临床症状，其可能原因是脊柱周围软组织及椎间盘的炎性反应导致脊神经受压[10]。

检测外周血中Th1细胞、Th17细胞数量，有助于判断布氏杆菌性脊柱炎病情及预后评估。CD4+T细胞在机体免疫中扮演重要角色。Th1细胞可分泌促炎细胞因子IFN-γ、IL-2等参与机体细胞免疫过程。研究显示，若Th1细胞异常活跃，可能会引起机体组织或器官损伤，或导致自身性免疫疾病发生[11]。IFN-γ、IL-2等细胞因子可清除外来细菌和病毒，在局部炎性反应中发挥着促炎作用。IFN-γ可激活巨噬细胞，促进炎性反应，从而参与关节炎的发病过程[12]。王翠玲等[13]研究显示，发作期的强直性脊柱炎患者外周血中Th1细胞百分比率比稳定期低，血清中IFN-γ、IL-2水平显著降低，可能因炎性反应作用向关节内迁移导致Th1细胞向关节内转移，从而导致外周血中Th1细胞百分比率降低。另有研究显示，宿主(如小鼠)体内Th2细胞水平增高，从而抑制Th1细胞的免疫反应，使Th1细胞/Th2细胞失衡，也会导致布氏杆菌病发生[14]。本研究发现，脊柱炎组患者术前外周血Th1细胞比例、血清IL-2、IFN-γ水平显著低于健康对照组，与庞盼等[15]研究结果相一致，提示Th1细胞比例可能与布氏杆菌性脊柱炎的发生有关，猜测外周血中Th1细胞比例下降可能是由于Th1细胞集中于脊关节部位，加重病情。术后复发亚组患者外周血Th1细胞比例及血清IL-2、IFN-γ水平显著低于未复发亚组，提示Th1细胞比例变化可能与布氏杆菌性脊柱炎患者术后复发密切相关。

Th17细胞是近年研究发现的Th细胞亚群，可参与机体局部微环境炎性反应。Th17细胞可分泌IL-17、IL-6、IL-23等促炎细胞因子，介导细胞免疫反应，与组织器官特异性免疫反应发病具有密切联系。Th17细胞与自身免疫性疾病的发生有紧密联系，若减弱Th17细胞的分化，降低IL-17、IL-23水平，可能会减轻自身免疫性疾病病情严重程度[16]。IL-17可通过作用于巨噬细胞、上皮细胞等，进一步促进促炎细胞因子的表达，并募集活化的中性粒细胞迁移至炎性反应部位和组织损伤部位[17]。IL-23可刺激Th17细胞的增殖，并延长细胞的生存期[18]。有文献报道，IL-23可通过与白介素-23受体(IL-23R)特异性结合，激活蛋白酪氨酸激酶，随后磷酸化信号转导子及转录激活子，激活IL-17的产生，IL-17、IL-23共同参与强直性脊柱炎发病机制[19-20]。孟珊等[21]研究发现，强直性脊柱炎患者外周血中Th17细胞百分比率较健康者高，且血清IL-17、IL-23、IL-6水平也显著升高。本研究发现，脊柱炎组患者术前外周血Th17细胞比例及血清IL-17、IL-6、IL-23水平显著高于健康对照组，提示Th17细胞比例增大可能会促进布氏杆菌性脊柱炎的发生。术后复发亚组患者外周血Th17细胞比例及血清IL-17、IL-6、IL-23水平显著高于未复发亚组，提示Th17细胞比例及IL-17、IL-23等细胞因子水平变化可能影响布氏杆菌性脊柱炎患者术后复发，猜测Th17细胞影响术后复发可能与Th17细胞具有促炎作用有关。但当前针对布氏杆菌性脊柱炎的研究结果甚少，且纳入研究对象仅有68例，可能使结果有所偏倚，对于其具体机制尚需深入探究。此外，Logistic回归分析显示，术后Th1细胞百分比、Th17细胞百分比、IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ均是布氏杆菌性脊柱炎术后复发的危险因素，提示监测布氏杆菌性脊柱炎患者外周血Th1细胞及Th17细胞百分比，对预估患者术后是否会出现复发可能具有重大意义。

综上所述，布氏杆菌性脊柱炎术后复发患者外周血Th17细胞百分率较高、Th1细胞百分率较低，可能参与布氏杆菌性脊柱炎患者术后复发。但本研究未深入研究Th1细胞、Th17细胞水平与布氏杆菌性脊柱炎术后复发机制的关系，后续还需进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

贾永利：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；杨新明：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；张培楠：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；孟宪勇：进行统计学分析；胡长波：课题设计，论文撰写