非小细胞肺癌原发和继发T790M突变的临床病理特征

吴彬，李玉强

(锦州医科大学附属第一医院临床生物样本中心，辽宁 锦州 121000)

在全世界范围内，肺癌是最为常见的恶性肿瘤，其死亡率排在所有癌症的第一位[1-2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)一般占到原发性肺癌的80%～85%，但其5年生存率较低，不足20%[3]。酪氨酸激酶在肿瘤的发生发展中发挥着极其重要的作用，以其为药物靶点的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)一直是抗肿瘤药物研发的重点，随着这个领域的不断成熟，EGFR-TKIs成为治疗NSCLC患者的重要手段，然而，几乎所有患者在应用 EGFR-TKIs 治疗后一年均会面临耐药的问题。EGFR-TKIs耐药的机制有很多，包括EGFR T790M突变的出现，MET扩增，组织学转化以及KRAS，BRAF或PIK3CA的突变[4-5]，其中T790M 突变是最常发生的耐药机制，不仅是导致继发耐药的主要原因[6]，一代和二代EGFR-TKIs原发[7]或继发耐药也都与之相关。近年来原发T790M突变随着检测技术的发展和检测方法的更新，其检出率表现出明显的增加趋势[8-10]。继发T790M突变往往得到临床的普遍关注和重视，而对原发T790M突变忽视或关注度不够，同时大部分研究是从继发T790M角度对各种肺癌临床进行分析研究，鲜有对原发与继发T790M突变两者在临床病理上的分析研究。本研究使用ARMS法检测原发和继发T790M的突变状态，并分析其与临床病理特征的关系，从而为选择后续治疗方案提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

由2014年1月至2018年12月锦州医科大学附属第一医院收治住院，行肿物活检、手术切除或胸腔积液抽取，并于病理科确诊为NSCLC的患者中筛选研究病例374例，将年龄、性别、病理组织分型、吸烟史及临床分期等临床病理特征建立成资料库。参照2015年世界卫生组织(WHO)及国际肺癌研究协会(IASLC)共同修订的肺和胸膜肿瘤分类标准确定病理组织分型，根据国际抗癌联盟(UICC)于2017年1月颁布实施的最新版肺癌TNM分期标准确定临床分期。纳入标准：(1)初次行EGFR检测的病例从尚未进行过化疗或者已经进行过化疗，但是没有毒副作用干扰的患者中选取，化疗对基因表达情况不产生影响[11]；(2)所有非原发T790M突变患者均有 EGFR基因18、19或者21 外显子上敏感位点的突变，并接受EGFR-TKIs(如吉非替尼、埃克替尼等靶向药)治疗。在病情有所进展后，通过穿刺手术取得患者活检新鲜组织或胸腔积液再次检测EGFR 基因突变情况，根据检测结果将患者分为T790M 突变组和无 T790M 突变组；(3)临床表征不足(年龄，性别，吸烟状况，组织学，疾病分类)的患者被排除在研究之外；(4)年龄≥18岁，且自愿签署知情同意书。每例标本的病理组织学诊断均由两位高年资病理科医师进行评估。研究经我院伦理委员会批准，并征得患者或家属的知情同意。

1.2 突变扩增阻滞系统 (amplification refractory mutation system， ARMS)法检测突变

应用ARMS-PCR法(ABI 7500 荧光定量PCR仪，美国应用生物公司)对EGFR基因进行检测，检测范围涵盖18、19、20和21这4个外显子上的29个热点突变(ADx-ARMS，艾德，YZB/国6377-2014)。根据EGFR检测试剂盒的说明书来设置反应参数，所有实验都设有阳性对照和阴性对照，保证结果的准确性。最终根据PCR的扩增曲线及CT值的cut-off值对结果进行判读。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。比较原发与继发T790M突变与 NSCLC 患者临床病理特点的关系时，计数资料采用(%)表示，行连续校正χ2检验或Fisher精确概率法(Fisher’s exact test)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理特征

374例NSCLC患者中先后发生T790M突变的共197例，其中女性T790M突变率高于男性(54.3%>45.7%)；中位年龄为59岁(27～88岁)，小于61岁占比46.7%，大于等于61岁占比53.3%；吸烟患者占比41.7%，不吸烟占比58.4%；病理组织分型中腺癌占比60.9%，非腺癌占比39.1%；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期占比38.6%，Ⅲ～Ⅳ期占比61.4%。T790M突变情况与性别、年龄、吸烟史等方面的差异无统计学意义(P>0.05)，与病理组织分型及TNM分期有统计学意义(P<0.05)，见表1。在374例NSCLC患者中，首次进行EGFR检测阴性结果有177例，在疾病进展后再次行EGFR基因检测，均无T790M突变情况。

2.2 原发与继发T790M突变与基因特征的相关性分析

在选取的374例非小细胞肺癌患者初次进行EGFR检测的结果中发现单独L858R发生突变168例，占非小细胞肺癌患者突变总数的44.9%；单独19-del发生突变159例，占非小细胞肺癌患者突变总数的42.5%；罕见突变36例，占非小细胞肺癌患者突变总数的9.6%；双突变共11例，占非小细胞肺癌患者突变总数的3%，其中T790M伴L858R突变的7例，T790M伴19-del突变的4例。初次行EGFR检测未发生T790M突变的患者接受吉非替尼、厄洛替尼或埃克替尼治疗后，病情进展再次进行T790M突变的检测，发现T790M突变186例，其中合并L858R突变的50例，合并19-del突变的136例。结果显示，T790M突变常和EGFR致敏突变一同出现，在原发T790M突变人群中，与19-del比较，L858R突变常合并T790M突变(63.6% vs 36.4%)，而这一比例在继发T790M突变人群中恰恰相反为26.9% vs 73.1%，原发和继发T790M突变在L858R和19-del分布差异存在统计学意义(P=0.009)。

表1 NSCLC患者T790M突变与临床病理特征的关系

3 讨 论

近年来对于非小细胞肺癌靶向药物的研究随着精准医疗时代的到来也变得越来越深入。其中靶向治疗的耐药性给患者的治疗带来了极大的难题，因此耐药的研究被越来越多的专家学者所重视。EGFR基因21号外显子上L858R敏感点突变以及19号外显子上19-del缺失突变这两种常见突变在临床上已经有较为深入的研究，而针对EGFR T790M突变与临床病理特征及分子改变情况的研究还不是很多。研究报道继发T790M突变率基本在一定范围内，为45%～60%之间[12-13]，本研究中继发T790M突变率为49.7%，与文献报道一致。然而原发T790M突变率的数值波动范围较大，在不同研究中数值差异很大，从较低的1%到80%[14-15]。导致原发T790M突变发生率波动范围较大原因可能如下：(1)检测技术，Sanger法检测EGFR突变人群原发T790M突变发生率在1%～8%[16-18]， AMRS法检测敏感性在2.75%～6.91%。本研究采用ARMS法进行检测，检出原发T790M突变率为3%，在文献报道范围内；(2)检测标本，原发T790M在新鲜冰冻标本的突变率高于石蜡包埋福尔马林固定标本[19]。虽然原发性EGFR T790M在临床上是一种少见的情况，但针对这部分患者的治疗方案还需要进一步深入研究。随着检测技术的不断发展，原发T790M的检出率也在不断增加，在临床治疗和指导预后等方面发挥着越来越重要的作用。

本研究在374例非小细胞肺癌患者中描述了含有原发与继发EGFR T790M突变患者的临床病理及分子特征。尽管T790M突变可以诱导EGFR-TKIs类药物耐药，但是它或许并不能成为诱发肿瘤的独立因素，必须与19外显子缺失及L858R突变共存才能诱导肿瘤发生。本研究中原发T790M突变常合并L858R并存，而继发T790M突变常合并19-del并存，针对这一研究结果的解释是19-del较L858R对TKIs敏感性更高[20]，经EGFR-TKIs治疗后T790M两次突变或亚克隆更容易在19-del中富集，另一种解释是L858R突变在促进肿瘤形成中需要更多其他基因改变协助完成。

总之，原发与继发性T790M突变检测在肺癌患者中具有巨大的潜在临床应用价值，随着这一研究领域的不断发展，为患者跟踪检测T790M的动态变化，不仅能及时评估靶向药物的疗效以及预后，同时有利于复发和转移的及早发现，更为患者治疗方案的合理化及个体化提供强有力的理论依据。然而由于本研究为小样本量的回顾性研究，缺乏大量的研究数据予以支撑结论，因此对非小细胞肺癌患者T790M突变的动态改变在临床治疗中的作用尚需进一步研究证实。我们认为对原发和继发T790M突变进行大样本的筛查研究十分必要，希望可以明确阐释T790M动态变化患者的临床病理特征及分子改变的相关性。