circSEC31A调控miR-324-5p对脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

刘畅，张荣明

(锦州医科大学附属第一医院烧伤整形外科，辽宁 锦州 121000)

脂肪移植是一种成熟的外科手术，在整形外科主要应用于快速修复缺损组织，是公认的具备再生特性的整形修复方式[1]。然而在脂肪移植中，脂肪细胞的存活成为手术治疗效果的关键[2]。脂肪干细胞是脂肪细胞的前体，能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞等，还能通过旁分泌途径调控多种生物学功能[3-4]。脂肪干细胞在增强脂肪移植效果中发挥着重要作用[5]。近期研究显示在成骨定向培养基诱导脂肪干细胞分化的细胞中存在171个circRNAs上调，119个circRNAs下调，其中circSEC31A为上调最为明显，然而其具体作用机制尚未进一步研究[6]。circRNAs是一类环状非编码RNA，没有游离的5'或3'末端，能够抵抗核酸外切酶诱导的降解，具有较好的稳定性[7]。目前研究显示circRNAs不仅能够调节细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移、自噬和耐药等生物学功能，还参与了肿瘤、免疫性疾病和代谢性疾病的调控[8-9]。研究显示脂肪干细胞外分泌的circ_0000250能够调控miR-128-3p/SIRT1通路参与糖尿病小鼠的伤口愈合[10]。然而circSEC31A在脂肪干细胞中发挥的作用及机制尚未阐明，因此本研究通过在脂肪干细胞中分别转染sh-circSEC31A和LV-circSEC31A后，探讨circSEC31A对脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化的作用和机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒、磷酸盐缓冲液、SDS-PAGE电泳液、胰蛋白酶和青霉素-链霉素购自中国碧云天生物技术有限公司；TRIzol试剂和SYBRGreen购自美国Promega公司；lipofectamine 3000和RNA反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；兔抗人RUNX2、OPN、GAPDH和HRP 标记的羊抗兔IgG购自美国Abcam公司；阴性对照shRNA(negative control-shRNA，sh-NC)、sh-circSEC31A、空载慢病毒(LV-NC)、LV-circSEC31A、miR-324-5p 阴性对照组(miR-NC)、miR-324-5p mimics和miR-324-5p inhibitors购自中国上海Genepharm公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干细胞培养与转染

脂肪干细胞由前期课题组分离并鉴定，细胞采用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，每2 d换液1次，细胞融合率达到80%后传代，取第三代对数生长期细胞，采用lipofectamine 3000对sh-NC、sh-circSEC31A、LV-NC、LV-circSEC31A、miR-NC、miR-324-5p mimics和miR-324-5p inhibitors进行转染。

1.2.2 RT-qPCR

采用TRIzol提取细胞中的总RNA，使用TaqMan MicroRNA Assay试剂盒检测miR-324-5p的表达水平，并使用Applied Biosystem 7500进行qPCR，U6作为内参。使用PrimeScript TM RT试剂盒从总RNA合成第一链互补DNA，并使用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR，以GAPDH为内参，按2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.3 CCK-8方法检测细胞增殖

取对数生长期脂肪干细胞，以2×103个/孔密度接种到96孔培养板中，每组设置5个复孔，在培养箱中分别培养0、1、2和3 d后，加入10 μL CCK-8，继续放回培养箱中培养2 h后，采用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

1.2.4 流式细胞仪细胞凋亡检测

采用PBS重悬细胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液(0.25 mg/mL)，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪进行检测。

1.2.5 双荧光素酶报告

将野生型(wild-type，WT)或突变型(mutant，MUT)circSEC31A克隆到pmirGLO质粒受体中，同时将miR-324-5p mimics或miR-NC导入脂肪干细胞中，共培养48 h后采用双荧光素酶受体分析系统测量双荧光素活性。

1.2.6 Western blot法

采用RIPA细胞裂解液冰上裂解各组细胞，使用BCA 试剂盒测定检测蛋白浓度。使用10%SDS-PAGE凝胶分离等量(50 μg)的蛋白质样品，110 V电泳，250 mA电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。分别加入RUNX2、OPN和GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3×30 min，ECL显影。并使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH作内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 circSEC31A对脂肪干细胞增殖和成骨分化的影响

在转染sh-circSEC31A后脂肪干细胞中circSEC31A的表达水平较转染sh-NC明显降低(P<0.01)，见图1A；进一步在细胞中转染LV-circSEC31A后，circSEC31A的表达水平较转染LV -NC明显升高(P<0.01)，见图1B。在脂肪干细胞增殖上，转染sh-circSEC31A后细胞的增殖能力明显降低(P<0.01)，见图1C，转染LV-circSEC31A后细胞的增殖能力明显增强(P<0.01)，见图1D。在脂肪干细胞成骨分化上，转染sh-circSEC31A后细胞中成骨分化相关分子RUNX2和OPN的mRNA和蛋白水平降低(P<0.001)，见图1E、图1F；转染LV-circSEC31A后细胞中成骨分化相关分子RUNX2和OPN的mRNA和蛋白水平升高(P<0.001)，见图1G、图1H。这提示低表达circSEC31A能够抑制脂肪干细胞增殖和成骨分化，过表达circSEC31A能够促进脂肪干细胞增殖和成骨分化。

与sh-NC或LV-NC组相比，**P<0.01；***P<0.001

2.2 circSEC31A对脂肪干细胞凋亡的影响

转染sh-circSEC31A后细胞的凋亡率明显升高(P<0.01)，见图2A，转染LV-circSEC31A后细胞的凋亡率明显降低(P<0.05)，见图2B。这提示低表达circSEC31A能够促进脂肪干细胞凋亡，过表达circSEC31A能够抑制脂肪干细胞凋亡。

2.3 circSEC31A能够靶向结合miR-324-5p

为进一步探讨circSEC31A调控脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化的作用机制，circSEC31A和miR-324-5p的靶点结合情况详见图3A；双荧光素酶结果显示：circSEC31A-WT组中转染miR-324-5p mimics后双荧光素活性明显下降(P<0.001)，见图3B；在circSEC31A-MUT组中转染miR-324-5p mimics后双荧光素活性未见明显改变(P>0.05)，见图3B；进一步在脂肪干细胞中转染sh-circSEC31A后能够明显促进miR-324-5p的表达水平(P<0.01)，见图3C；在转染LV-circSEC31A后能够明显抑制miR-324-5p的表达水平(P<0.05)，见图3D；同时在脂肪干细胞中转染miR-324-5p mimics后能够明显促进miR-324-5p的表达水平(P<0.01)，见图3E；转染miR-324-5p inhibitors后能够明显抑制miR-324-5p的表达水平(P<0.01)，见图3E。这提示circSEC31A可能通过靶向结合miR-324-5p调控脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化。

2.4 circSEC31A通过调控miR-324-5p影响脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化

在脂肪干细胞中共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p mimics后，脂肪干细胞增殖能力和单独转染LV-NC组未见明显差异(P>0.05)，见图4A；在共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p inhibitors后，脂肪干细胞增殖能力较单独转染LV-circSEC31A后进一步加强(P<0.05)，见图4B；在脂肪干细胞中共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p mimics能够逆转单独转染LV-circSEC31A对脂肪干细胞中成骨分化相关分子RUNX2和OPN的mRNA和蛋白表达水平(P>0.05)，见图4C、图4D；共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p inhibitors能够进一步加强单独转染LV-circSEC31A对脂肪干细胞中成骨分化相关分子RUNX2和OPN的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01)，见图4E、图4F；在脂肪干细胞凋亡上，共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p mimics后脂肪干细胞凋亡率和单独转染LV-NC组未见明显差异(P>0.05)，见图4G；在共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p inhibitors后脂肪干细胞凋亡率较单独转染LV-circSEC31A后进一步降低(P<0.05)，见图4H。

这提示过表达circSEC31A通过靶向调控miR-324-5p促进脂肪干细胞增殖和成骨分化，抑制细胞凋亡，见图4。

与sh-NC或LV-NC组相比，*P<0.05；**P<0.01

与miR-NC，sh-NC或LV-NC组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；与miR-NC组相比，##P<0.01

3 讨 论

脂肪干细胞在整形外科中的应用越来越受到重视，目前脂肪干细胞可以应用到软组织填充、创面修复、骨与软骨缺损和皮肤年轻化等多方面的治疗[11]。然而脂肪干细胞的存活依旧是治疗效果的关键。在脂肪移植中脂肪细胞的存活率在40%～50%左右，当脂肪细胞坏死后会出现感染、炎症、钙化等多种严重并发症，给治疗效果和患者治疗后的体验带来严重挑战[12]。临床上为提高脂肪存活率一般通过脂肪采集、脂肪处理和移植区域填充保证脂肪细胞存活[13]。研究显示采用壳聚糖支架、硫化氢、米诺环素、人参皂甙等多种方式能够提高脂肪干细胞的存活率[14]。因此，探寻提高脂肪干细胞存活率的方式在整形外科脂肪移植中具有重要意义。

研究显示circSEC31A在成骨定向培养基诱导脂肪干细胞分化的细胞中明显高表达，其作用机制尚未明确[6]289-302。在本研究中采用sh-circSEC31A和LV-circSEC31A分别低表达和过表达脂肪干细胞中circSEC31A的表达水平，结果显示低表达circSEC31A能够明显抑制脂肪干细胞的增殖、成骨分化和促进细胞凋亡，过表达circSEC31A能够明显促进脂肪干细胞的增殖、成骨分化和抑制细胞凋亡。这体现circSEC31A在调控脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化中发挥重要作用。研究显示circCDR1能够通过调控miR-7/GDF5/SMAD和p38 MAPK介导牙周膜干细胞的成骨分化[15]。也有研究显示circRFWD2和circINO80能够靶向结合miR-6817-5p调控NELL-1诱导的脂肪干细胞成骨分化[16]。然而circSEC31A参与调控脂肪干细胞生物学功能的机制有待进一步研究。

circSEC31A作为circRNAs一类分子，其主要调控方式是通过ceRNA机制靶向结合miRNAs[17]。数据库预测(https://circinteractome.nia.nih.gov)结果显示circSEC31A能够靶向结合的miRNAs包括miR-1179、miR-1253、miR-1263、miR-197、miR-324-5p、miR-383、miR-409-3p、miR-502-5p、miR-587、miR-607、 miR-616和miR-766 。研究显示miR-324-5p能够通过靶向结合KLF3调控脂肪干细胞的分化和小鼠中脂肪的积累[18]。本研究双荧光素酶结果显示circSEC31A能够靶向结合miR-324-5p，同时过表达circSEC31A能够抑制脂肪干细胞中miR-324-5p的表达水平，低表达circSEC31A能够促进脂肪干细胞中miR-324-5p的表达水平。研究显示miR-150能够靶向调控Notch3介导脂肪干细胞的成脂分化[19]。也有研究显示miR-145-5p能够靶向结合Sema3a抑制导脂肪干细胞的成骨分化[20]。这提示circSEC31A可能通过靶向结合miR-324-5p调控脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化。

与LV-NC组相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；与LV-circSEC31A组相比，#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001

在进一步的回复实验中，为验证circSEC31A通过靶向结合miR-324-5p调控脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化，在脂肪干细胞中共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p mimics后能够反转单独转染LV-circSEC31A对脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响；共转染LV-circSEC31A和miR-324-5p inhibitors后能够进一步加强单独转染LV-circSEC31A对脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响。这显示circSEC31A能够通过靶向调控miR-324-5p参与脂肪干细胞增殖、凋亡和成骨分化，circSEC31A可能成为干预脂肪干细胞生物学功能的靶点。