复配低聚糖的抑菌性研究

◎ 李永幸，李 红，任昭瑾

（1.商丘市食品药品检验检测中心，河南 商丘 476000；2.新郑市食品药品检验检测中心，河南 新郑 451100）

抗菌素的大量使用不但逐步提高了细菌的耐药性，也同时使环境受到了严重的污染[1]，而环境中的食源性病菌能引起食物腐败变质，使人们的健康受到严重威胁[2]。近年来，安全性高、具有抗菌性能的低聚糖获得相关研究人员的高度关注，例如，壳低聚糖、褐藻胶低聚糖、果胶低聚糖等[3-5]。

壳低聚糖是壳聚糖降解后的产物，呈浅黄色或浅棕色，理化性质稳定，易溶于水[6]。壳低聚糖的聚合度为2 ～10、平均分子量5 ～30 kDa，是自然界中唯一含有正电荷的碱性氨基低聚糖，壳低聚糖的抑菌性能也多有报道[7-8]。果胶在自然中广泛存在，其降解产物果胶低聚糖被认为具有一定的抑菌功能[9]。李托平等通过山楂果胶低聚糖与其他食品添加剂的复配对食品腐败枯草芽孢杆菌的抑菌性进行了研究，结果表明复配后比单独使用时的抑菌效果强[10]。褐藻胶低聚糖由褐藻酸钠降解获得，是一种小分子低聚糖，与大分子褐藻酸钠相比，其分子量低，易溶于水，具有多种生物活性，在食品、生物医药等领域受到专家学者的高度关注[11]。其在致病菌的抑制方面也表现出一定的效果，YAN G L 等的试验表明，褐藻胶低聚糖对沙门氏菌有较强的抑制作用[12]。壳聚糖及壳寡糖具有良好的抗菌活性，其抗菌机制也见于报道。Mekasha 等研究表明，壳寡糖与几丁质相比，其结构中的伯氨基是抗菌的主要原因[13]。黄海波等研究表明，壳寡糖具有较好的抑菌活性[14]。

本文采用不同种类的低聚糖对金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，并根据单因素试验结果，利用正交设计的方法对不同种类的低聚糖进行复配，以研究复配低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，为其在新型食品抑菌剂的研究利用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与主要试剂

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），购自北纳生物。

壳低聚糖、果胶低聚糖（纯度98%）、褐藻胶低聚糖（纯度99%），均购自西安百川生物科技有限公司；营养肉汤、琼脂粉，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Hve-50 型高压灭菌锅，购自Hirayama 公司；LRH-250 型恒温培养箱，购自郑州生元仪器有限公司；UW220H 型电子天平，购自日本岛津公司。

1.3 培养基制备

液体培养基：营养肉汤18 g·L-1，分装至250 mL三角瓶中，每瓶50 mL，121 ℃灭菌20 min。固体培养基为营养肉汤液体培养基中加入15 g·L-1琼脂粉。

1.4 菌悬液的制备

菌种先于固体培养基上连续复壮两次，用接种环挑取单菌落至液体培养基中培养，得到菌悬液，备用。

1.5 抑菌活性测定

采用平板计数法测定低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性。以1%的乙酸为溶剂，制备成不同浓度的低聚糖抑菌液，用无菌生理盐水将菌悬液的浓度稀释至1×108CFU·mL-1，然后取0.1 mL 菌悬液和0.1 mL 抑菌液均匀涂布在培养基平板上。空白样为以0.1 mL 溶剂替代0.1 mL 抑菌液，其余与样品相同。每组3 个平行，平板于37 ℃培养箱中培养24 h，记录各个平板上的菌落数，计算抑菌率，抑菌率为样品菌落数/空白样菌落数×100%。

1.6 单因素试验

1.6.1 壳低聚糖抑菌性的单因素试验

调节壳低聚糖的初始浓度，依次为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%。其他条件不变，按1.5 方法考察壳低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能。

1.6.2 褐藻胶低聚糖抑菌性的单因素试验

调节褐藻胶低聚糖的初始浓度，依次为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。其他条件不变，按1.5 方法考察褐藻胶低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能。

1.6.3 果胶低聚糖抑菌性的单因素试验

调节果胶低聚糖的初始浓度，依次为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%。其他条件不变，按1.5 方法考察果胶低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能。

1.7 正交试验

根据单因素试验结果，应用正交设计助手Ⅱv3.1对低聚糖进行复配，进行3 因素3 水平正交试验，水平因素见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 不同浓度壳低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

由图1 可知，随着壳低聚糖浓度的增大，样品对金黄色葡萄球菌的抑菌率逐渐增大，其中壳低聚糖浓度在0.2%～0.4%时，增速变缓，在0.4%时抑菌率达到85.5%。

2.2 不同浓度褐藻胶低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

由图2 可知，褐藻胶低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑制率随其浓度的增加而提高，浓度为0.05%～0.3%时，抑菌率增速明显。当浓度为0.5%时，抑菌率最大，为77.5%。

图1 不同浓度壳低聚糖的抑菌率图

图2 不同浓度对褐藻胶低聚糖的抑菌率影响图

2.3 不同浓度果胶低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

果胶来源广泛，其分解产物果胶低聚糖具有一定的抑菌功能。王江浪对苹果果胶低聚糖抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效果进行了研究，结果表明其对这两种细菌都有较好的抑制作用[15]。本实验对不同浓度的果胶低聚糖抑制金黄色葡萄糖球菌的效果进行研究，结果如图3 所示。

图3 不同浓度果胶低聚糖的抑菌率图

由图3 可知，高浓度的果胶低聚糖比低浓度的抑菌效果强，浓度0.7%时，抑菌率达到82.4%，表明金黄色葡萄球菌对高浓度的果胶低聚糖更敏感。

2.4 低聚糖抑菌性的正交试验

表2 及表3 表明，3 种因素对金黄色葡萄球菌的抑菌性的主次顺序为A ＞B ＞C，即壳低聚糖浓度对金黄色葡萄糖球菌的抑菌性影响最大，其次为褐藻胶低聚糖浓度，果胶低聚糖浓度影响最小，且壳低聚糖浓度的影响显著，其最优组合为A3B3C3。在正交试验的最优组合下进行抑菌试验，复配低聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌率为95.2%±0.6%，高于正交表中组合，表明其最佳复配浓度为：壳低聚糖0.2%，褐藻胶低聚糖0.3%，果胶低聚糖0.5%。

表2 正交试验设计与结果分析表

表3 方差分析表

3 结论

本实验通过单因素及正交设计的方法对低聚糖浓度进行优化，得到最佳浓度，并对该浓度进行验证，其最佳浓度组合为：壳低聚糖0.2%，褐藻胶低聚糖0.3%，果胶低聚糖0.5%，抑菌率达到95.2%±0.6%。