2型糖尿病大鼠心室肌细胞离子通道功能和表达变化*

刘沛明， 郑丹琳， 张 利， 周梦园， 练飞鸿， 邝素娟，杨 慧， 饶 芳， 邓春玉1，△

［华南理工大学 1医学院，2生物科学与工程学院，广东广州510006；3广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究部临床药理重点实验室，广东广州510080］

近年来糖尿病的患病率不断增加，影响全球超过4.4 亿人，中国约有1.1 亿糖尿病患者，是目前世界上糖尿病患者最多的国家，其中以2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）为主［1］。T2D 是一种由胰岛素抵抗和由胰岛素相对缺乏引起的以肥胖、高血糖和高血脂为特征的代谢紊乱综合征，占所有类型糖尿病的90%以上，且其患病率在全球范围内迅速上升［2］。

糖尿病心血管疾病的并发症与其死亡率密切相关。越来越多的研究表明，糖尿病可增加心律失常相关疾病的发生，包括房性和室性心律失常、QT 间期延长［3］和心源性猝死［4］等。糖尿病还可通过影响心脏的传导系统诱导心律失常，包括心房颤动、束支传导阻滞［5］、缓慢性或快速心律失常和房室传导阻滞［6-7］等。在糖尿病患者中，长QT 综合征、频发室性早搏和左室肥厚伴舒张功能障碍等异常情况显著增加［8］。糖尿病和心律失常之间的关系是复杂的，受到多因素的影响。有研究表明1 型糖尿病可影响一系列离子通道电流，包括L 型钙电流（L-type calcium channel current，ICa-L）［9］和瞬时外向钾电流（transient outward potassium current，Ito）［10］。但目前2 型糖尿病在此方面的研究报道不多，本研究以2 型糖尿病大鼠为模型，探讨其心肌细胞中Ito和ICa-L及相关蛋白表达水平的改变。

材料和方法

1 实验动物

SPF 级7 周龄雄性Zucker diabetic fatty（ZDF）大鼠和Zucker lean（ZL）大鼠各8 只购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2012-0001。饲养于中山大学北校区动物中心，恒温（22±2）℃，恒湿（55±5）%，人工光照每天明暗各12 h，噪声＜50 dB，24 h 自由取食和饮水。本研究所有动物实验已通过广东省人民医院（广东省医学科学院）的动物实验伦理审查（No.GDREC201208A）。

2 试剂与仪器

抗β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗体（Aviva Systems Biology）；抗心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗体（Abcam）；抗GAPDH 抗体、抗Cav1.2 抗体和抗Kv4.3 抗体（Cell Signaling Technology）；4× SDS 上样缓冲液、脱脂奶粉和Loading Buffer（Bio-Rad）；RIPA 细胞裂解液和PVDF膜（Millipore）；DMEM 培养液和胎牛血清（Gib⁃co）；磷酸 缓 冲盐溶 液（phosphate-buffered saline，PBS；武汉博士德公司）。Langendorff 恒流灌流装置、MultiClamp 700B 放大器、Digidata 1440A 数模转换器和pCLAMP 10.2 数据采集分析软件（Axon）；P-97 拉制仪（Sutter Insrument Company）。

3 实验溶液

动作电位细胞外液包含（mmol/L）：145 NaCl，4 KCl，1 MgCl2，1.8 CaCl2，10 HEPES，使用NaOH 调节pH 至7.4；电极内液包含（mmol/L）：120 aspartic acid，25 KCl，1 MgCl2，10 EGTA，2 sodium phospho⁃creatine，4 Na2ATP，2 Na2GTP，5 HEPES，使用KOH调节pH至7.2。

记录Ito时，细胞外液包含（mmol/L）：140 NaCl，4 KCl，1 MgCl2，10 HEPES，2 CaCl2，10 glucose，0.5 CdCl2，使用NaOH 调节pH 至7.4；电极内液包含（mmol/L）：90 mg/L potassium aspartate，20 KCl，10 HEPES，1 MgCl2，5 Na2ATP，5 EGTA，使用KOH 调节pH至7.2。

记录ICa-L时，细胞外液成份为（mmol/L）：140 TEA-Cl，5 CaCl2，2 MgCl2，10 HEPES，10 glucose，使用CsOH 调节pH 至7.4；电极内液使用高Cs+溶液（mmol/L）：100 CsCl，20 TEA-Cl，5 Na2ATP，0.4 Na2GTP，10 EGTA，10 HEPES，使用Tris 将pH 调至7.2。

KB 液成份为（mmol/L）：50 potassium glutamate，20 KOH，40 KCl，20 KH2PO4，20 taurine，10 glucose·H2O，3 MgCl2·6H2O，0.5 EGTA，10 HEPES，20 KOH，使用NaOH 将pH调至7.4。分装至50 mL离心管，-80℃冰箱保存。

4 主要方法

4.1 T2D 动物模型的建立 将实验动物分为对照组（ZL组）和模型组（ZDF组），ZL组大鼠给予普通饲料喂养，ZDF 组大鼠给予Purina 5008 饲料（蛋白质23.75%、总脂肪7.55%、粗纤维4.00% 和消化能14.6 kJ/kg）喂养。饲养1周后，使用罗氏血糖检测试纸和血糖仪，通过尾静脉采血法定期对两组大鼠进行血糖的测量，并利用电子天平测量大鼠的体重。之后分别在第8、10、13 和17 周进行血糖和体重的测量。

4.2 Western blot 实验检测相关蛋白的表达 采用颈椎脱臼法处死大鼠，剪开胸腔并用PBS 溶液清洗心脏后，留取心室肌组织，储存于-80℃冰箱中。提取蛋白时从冰箱取出心室肌组织，剪取绿豆大小的心肌组织放进冰上已加入300 μL 4℃的RIPA Lysis Buffer（含1%Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ）的EP管中，使用剪刀在EP 管中剪碎组织，用UP200S 超声粉碎仪在冰上对组织进行超声粉碎30 s，后把EP 管置于离心机中，4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液置于另一EP 管中。用BCA 法于多功能酶标仪中测定蛋白浓度。用RIPA 调至蛋白浓度相等，加入Loading Buffer 后变性10 min。SDS-PAGE 分离蛋白、转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST 洗膜3 次，加入Ⅰ抗4℃孵育过夜；TBST洗膜3次后根据Ⅰ抗来源选择合适Ⅱ抗，以1∶1 000 的比例稀释于5%脱脂奶粉中常温孵育1 h，TBST 洗膜3 次。用ECL 试剂盒显影蛋白条带，用ImageJ 图像分析软件分析目的蛋白及内参照蛋白的吸光度，并算出比值进行比较。

4.3 心肌细胞麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色和细胞表面积的计算 采用颈椎脱臼法处死大鼠，取心室组织后用PBS 冲洗，4%甲醛固定24 h，脱水、石蜡包埋切片。室温下用PBS 孵育水化后滴加胰酶工作液50 μL，在37℃湿盒孵育15 min，PBS 漂洗终止消化，滴加WGA-AF488 工作液（1∶100稀释），避光孵育2 h，PBS 漂洗，并用封固剂封片，光学显微镜下拍照。应用Image-Pro Plus 6.0 软件以400 倍标尺为标准，选取合适的视野，测量视野内组织的面积及细胞核的总数，得出单个细胞面积，单个细胞面积（μm2）=组织面积（μm2）/细胞核总数。

4.4 大鼠心室肌细胞的全细胞膜片钳实验 约200～250 g 大鼠用颈椎脱臼法处死，迅速开胸取出心脏，行主动脉逆行插管，Langendorff恒流灌流装置对离体心脏进行灌流，采用酶解法分离大鼠单个心室肌细胞。37℃预温灌流液（2.75 g MEM 培养基溶于250 mL 蒸馏水中，加NaOH 使pH 调至7.35）和含酶消化液（40 mL 灌流液+0.04 g 牛血清白蛋白+0.02 g胶原酶）。先用灌流液灌流心脏约5 min，然后改用消化液灌流约40～50 min，直到组织结构疏松，滴出的液体成拉丝状，剪取左心室部分组织，置于KB 液中剪碎，毛细吸管轻柔吹打至细胞分散，室温静置10 min，去上清，用KB 液洗2 遍，再用KB 液重悬，4℃保存备用。

采用MultiClamp 700B 放大器的全细胞膜片钳（Axon Instruments）记录单个心室肌细胞的相关指标。显微镜下选取横纹清晰、贴壁良好的单个心肌细胞，使用三维操纵器使电极进入细胞外液，测试电极电阻为2～5 MΩ 为合格，可继续用于实验。电极接触细胞后，轻吸细胞膜形成GΩ封接破膜。电流幅度稳定后进行补偿，按照参数设置分别记录各电流。使用Digidata 1440A 数模转换器和pCLAMP 10.2 数据采集分析软件，用MultiClamp 700B 放大器记录电流信号并存储在计算机的硬盘上。GraphPad Prism 8用于分析离子通道电流密度及复活曲线、失活曲线和动作电位时程（action potential duration，APD）曲线拟 合，计算复 极50% 和90% 电 位时 程（APD50和APD90）。

5 统计学处理

用SPSS Statistic 25 统计软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 8 将统计结果绘制成图。计量资料以均数±标准误（mean±SEM）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 糖尿病大鼠模型的建立

将7周龄ZL和ZDF大鼠适应性喂养7 d后，ZDF大鼠改为Purina 5008 饲料喂养。10 周龄后，ZDF 组大鼠血糖和体重均显著高于ZL 组（P＜0.01），见图1A、B。与ZL 组相比，ZDF 组大鼠左心室收缩末期容积［（171.08±23.41）μL vs（92.25±5.43）μL］、舒张 末 期 容 积［（383.30±39.87）μL vs（281.42±13.79）μL］、收缩末期内径［（5.78±0.34）mm vs（4.78±0.12）mm］和舒张末期内径［（8.32±0.38）mm vs（7.29±0.16）mm］均显著减小（P＜0.05），提示糖尿病大鼠心脏功能受损。

2 糖尿病大鼠心肌细胞肥大相关蛋白的检测

利用Western blot 技术检测ZL 组及ZDF 组大鼠心室肌细胞肥大相关蛋白β-MHC 和ANP 的变化，结果显示，与ZL 组相比，ZDF 组大鼠心肌细胞中β-MHC 和ANP 表达均显著升高（P＜0.05），见图1C。WGA 染色显示，心室肌细胞表面积显著增加（P＜0.01），见图1D。

3 糖尿病大鼠心室肌细胞APD的变化

Figure 1. Changes of blood glucose（A），body weight（B），and β-MHC and ANP protein expression in the ventricular myocytes（C），and the WGA staining results of the myocardial cells（D，×400）in ZDF rats. Mean±SEM. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs ZL group.图1 ZDF大鼠血糖、体重、心室肌细胞β-MHC和ANP蛋白的表达变化及心肌细胞的WGA染色结果

与ZL组相比，ZDF组大鼠心室肌细胞APD显著延长，APD50和APD90均显著增加［（9.91±1.60）ms vs（67.74±10.58）ms，（39.95±3.19）ms vs（133.53±17.37）ms，P＜0.01］，见图2。

4 糖尿病大鼠心室肌细胞Ito及心室组织Kv4.3 蛋白表达的变化

糖尿病大鼠心室肌细胞Ito密度显著低于对照组。10 mV 时，ZL 组和ZDF 组大鼠Ito分别为（4.18±0.36）pA/pF 和（2.25±0.20）pA/pF（P＜0.01）；50 mV 时 分别 为（11.02±0.74）pA/pF 和（6.71±0.52）pA/pF（P＜0.01）；60 mV 时分别为（12.43±0.86）pA/pF和（7.48±0.58）pA/pF（P＜0.01），见图3A。

Ito的激活、失活及复活动力学均无显著差异。如图3B、C 激活/失活及复活曲线所示，ZL 组和ZDF组大鼠心室肌细胞激活曲线的V50分别为（24.13±1.71）mV 和（25.47±1.67）mV（P＞0.05），失活曲线的V50分别为（-30.40±1.97）mV 和（-29.18±1.21）mV（P＞0.05）；ZL 组和ZDF 组大鼠心室肌细胞激活曲线的斜率分别为17.23±0.68 vs 15.42±0.70（P＞0.05），失活曲线的斜率分别为-3.27±0.13 vs -2.68±0.27（P＞0.05）；ZL 组和ZDF 组大鼠心室肌细胞复活曲线τ 值分别为29.59±1.78 和24.39±1.22（P＞0.05）。

Western blot 结果显示，糖尿病大鼠心室组织中Kv4.3 蛋 白的 表 达水 平 明显 下 调（P＜0.05），见图3D。

5 糖尿病大鼠心室肌细胞ICa-L及心室组织Cav1.2蛋白表达的变化

糖尿病大鼠心室肌细胞ICa-L密度显著低于对照组。10 mV时，ZL组和ZDF组大鼠心室肌细胞的ICa-L分别为（-5.35±0.32）pA/pF 和（-4.23±0.26）pA/pF（P＜0.01）；30 mV 时分别为（-3.10±0.24）pA/pF 和（-2.14±0.18）pA/pF（P＜0.01）；40 mV 时分别为（-2.04±0.20）pA/pF 和（-1.32±0.16）pA/pF（P＜0.01），见图4A。

Figure 2. Action potential duration（APD）of ventricular myocytes isolated from ZL and ZDF rats. A：the representative action po⁃tential recorded in representative isolated ventricular myocytes from ZL and ZDF rats with a perforated patch configuration at 2 Hz；B，C and D：action potential amplitude（APA），APD at 50% of the amplitude（APD50）and APD at 50% of the amplitude（APD90）of the ventricular myocytes were calculated. Mean±SEM. n=12～14. **P＜0.01 vs ZL group.图2 ZL和ZDF大鼠心室肌细胞动作电位

ICa-L的激活、失活及复活动力学均无显著差异。如图4B、C 激活/失活及复活曲线所示，ZL 组和ZDF组大鼠心室肌细胞激活曲线的V50分别为（-25.79±1.63）mV 和（-25.63±2.06）mV（P＞0.05）；失活曲线 的V50分别 为（-39.04± 2.39）mV 和（-29.11±3.14）mV（P＞0.05）；ZL 组和ZDF 组大鼠心室肌细胞激活曲线的斜率分别为6.01±0.34 和4.92±0.12（P＞0.05）；失活曲线的斜率分别为-4.20±0.47 和-5.01±0.78（P＞0.05）；ZL 组和ZDF 组大鼠心室肌细胞复活曲线的τ 值分别为74.42±5.43 和76.78±5.01（P＞0.05）。

Western blot 结果显示，糖尿病大鼠心室组织中Cav1.2 蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05），见图4D。

讨 论

要深入研究T2D 必须建立合适的动物模型。在各种动物模型中，ZDF 大鼠在研究肥胖相关的T2D中应用最为广泛。本实验选取了ZDF 大鼠，参考王祥等［11］和Guo 等［12］的方法成功构建了T2D 大鼠模型，研究糖尿病疾病状态时心室肌细胞电重构相关蛋白及通道电流的变化。根据练飞鸿等［13］的研究，糖尿病大鼠可出现心肌细胞体积增加、ANP 水平增高、体重及总心脏重量增加等变化；Loganathan 等［14］也发现糖尿病大鼠心脏舒张末期容积减小，且平均射血体积降低。用Purina 5008 饲料饲养后，ZDF 大鼠在10 周龄左右出现了随机血糖和体重显著升高，左心室收缩末期容积、左心室舒张末期容积、左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径均显著降低，提示ZDF 组大鼠出现了心功能异常。检测ZL 及ZDF 大鼠心肌组织中肥大相关蛋白，发现ANP 及β-MHC 明显上调，WGA 染色结果提示糖尿病大鼠心室肌细胞面积显著增加。上述结果说明，在长期高血糖刺激下，ZDF大鼠心脏发生了肥大变化，与临床上糖尿病患者的心脏病理变化及练飞鸿等［13］对糖尿病大鼠模型的研究结果一致，提示T2D 大鼠模型成功建立。

Figure 3. Ito density，activation/inactivation and reactiration curves，and Kv4.3 protein expression in ventrcular myocytes of ZL and ZDF rats. A：Ito traces were recorded in a representative ventricular myocyte of ZL nad ZDF rats using voltage steps of 400 ms steps to between -40 mV and 60 mV from 50 mV at 0.2 Hz；B：representative current recordings were used to deter⁃mine voltage dependence of Ito inactivation using 1 000 ms prepulses from holding potential of -80 mV to 30 mV，to 50 mV for 300 ms，and then back to -80 mV；C：recovery of Ito from inactivation in ZL and ZDF rat ventricular myocytes using paired 300 ms pulses to 50 mV from a holding potential of -80 mV with variable intervals；D：the protein expression of Kv4.3 in the ZL and ZDF rats. Mean±SEM. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs ZL group.图3 ZL和ZDF大鼠心室肌细胞Ito密度、激活/失活和复活曲线及Kv4.3蛋白的表达

根据以往研究［15］，糖尿病可导致心脏传导系统发生缺陷。我们研究发现T2D 大鼠心室肌细胞动作电位时程延长，这与Nobe 等［16］在在利用链脲霉素诱导的Wistar 大鼠糖尿病模型上检测到的结果相一致。糖尿病大鼠单个心室肌细胞的动作电位轮廓与对照组相似，在部分心肌细胞中，动作电位延长，静息膜电位或动作电位振幅并没有改变［14］。长期糖尿病患者心电图校正的QT 间期延长，可能与高糖可导致心室肌细胞动作电位时程延长有关。有研究报道在糖尿病动物模型中，心肌Ito在动作电位复极和重构中起着关键作用，Ito-f调节切迹电位和平台电位，并调节ICa-L的时程和幅度，减慢Ito-f失活会导致动作电位显著缩短［17］。Ito幅值降低、Kv4.3 和Kv4.2 通道蛋白表达减少可能与糖尿病大鼠复极延长有关［18］。本研究结果提示，T2D大鼠心室肌细胞Ito密度明显低于对照组，但其激活和失活动力学没有明显的改变；Kv4.3 蛋白的表达下降，这一结果与Ito密度变化一致。

L 型Ca2+通道是细胞内Ca2+内流的主要途径，其功能在心脏中有十分重要的地位，它可以触发兴奋-收缩偶联，调节动作电位的形状，并参与心律失常［19］。在本研究中，T2D 模型大鼠心室肌细胞的ICa-L显著降低，同时L 型钙通道Cav1.2 的蛋白表达与对照组相比明显下降。但L 型Ca2+通道激活和失活的电压依赖性没有明显改变。这一结果与Pandit 等［20］的研究结果一致。

Figure 4. ICa-L density，activation/inactivation and reactivation curves，and Cav1.2 protein expression in ventricular myocytes of ZL and ZDF rats. A：representative ICa-L traces were recorded using voltage steps of 300 ms steps to between -60 and 60 mV from the holding potential -80 mV at 0.2 Hz in ZL and ZDF rat ventricular myocytes；B：representative current recordings were used to determine voltage dependence of ICa-L inactivation using 1 000 ms prepulses from holding potential of -80 mV to between -100 and 80 mV and back to 0 mV for 300 ms，then subjected to -80 mV；C：recovery of ICa-L from inactiva⁃tion using paired 300 ms pulses to 10 mV from a holding potential of -80 mV with 50 ms intervals in ZL and ZDF ventricu⁃lar myocyte；D：the protein expression of Cav1.2 in the ZL and ZDF rats. Mean±SEM. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs ZL group.图4 ZL和ZDF大鼠心室肌细胞ICa-L密度、激活/失活和复活曲线及Cav1.2蛋白的表达

综上所述，本研究通过建立ZDF 大鼠糖尿病动物模型，证实了2 型糖尿病可导致心室肌细胞ICa-L和Ito等离子通道电流的下降，相关离子通道蛋白Cav1.2 和Kv4.3 表达降低。与1 型糖尿病［18］及2 型糖尿病啮齿动物［21-22］等研究结果相互补充，更完整、有力地阐述了糖尿病病理状态下对心室肌细胞电生理重构的影响，为阐明糖尿病心律失常提供了理论依据。但高血糖是通过何种机制影响通道蛋白及其电流的变化目前尚无定论。阐明这些机制的发生与发展，理清其上下游关系将对预防与治疗糖尿病心律失常有着重要的意义。