p53在层流剪切应力下对EPCs分化及功能的影响*

王美月， 贺燕婷， 于 洁， 崔晓栋， 成 敏， 张晓芸

（潍坊医学院基础医学院，山东潍坊261053）

目前心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）占据人类死因的首位［1］，内皮损伤与修复的失衡导致的内皮功能障碍是众多心血管疾病的主要原因［2］。内皮损伤可通过损伤部位附近内皮细胞的局部迁移和增殖，或通过祖细胞的动员并加入损伤部位来修复。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）存在于循环系统中，当血管产生损伤时，EPCs由骨髓动员到受损部位，通过增殖并向内皮细胞分化参与受损血管的内皮修复，在参与及维持血管的正常功能中起着重要作用［3-4］。EPCs 因为其较高增殖、迁移以及血管形成能力成为了再生心血管医学治疗内皮损伤以及缺血性损伤的有效工具及重要靶点［5］。

剪切应力（shear stress，SS）是由血管壁上血液流动产生的流体动力，在维持内皮稳态中起着重要作用［6-7］。文献及我们前期的实验表明，血流产生的剪切应力能对EPCs 分化及血管修复能力起调节作用，稳定的层流剪切应力（laminar shear stress，LSS）会促进内皮祖细胞向内皮细胞分化并增强其血管修复能力［8-9］，但具体机制并不十分明朗。

p53 在细胞内的生物学功能主要是对外界各类应激原产生应答，启动损伤的DNA 修复，维持基因组的稳定，因此p53 曾被称为“基因组卫士”。近年来，随着研究的深入，人们发现p53 还参与众多细胞的分化与转分化。Lin 等［10］的实验表明，LSS 可以通过p53 调节内皮细胞的凋亡，维持血管内皮的稳定。LSS 是否能够通过p53 调节EPCs 的功能及分化尚未见报道。本研究主要探讨了LSS 通过p53 对EPCs 功能及分化的影响，以期探寻潜在的生物靶点分子。

材料和方法

1 主要试剂和材料

SD 大鼠购自济南朋悦实验动物繁殖中心，许可证号为SCXK（鲁）2019-0003。EGM-2MV 培养基（Lonza）；M199 培养基和Trizol 试剂（Invitrogen）；纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、Histopaque-1083 淋巴细胞分离液和FITC-UEA-1（Sigma）；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（Hyclone）；Matrigel（BD）；pifithrin-α（Selleck）；DiI-Ac-LDL（上海懋康生物科技有限公司）；vWF 酶联免疫吸附测定试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；CCK-8 检测试剂盒（Dojindo）、EdU 检测试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；荧光定量PCR 试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］；抗p-p53 抗体、抗p53 抗体、抗CD31 抗体和抗vWF 抗体（Abcam）；抗CD45抗体（Cyagen）；抗血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor recep⁃tor 2，VEGFR2）抗体（Cell Signaling Technology）。

2 主要方法

2.1 骨髓单个核细胞分离、培养与晚期EPCs 的鉴定 将大鼠颈椎脱臼处死，置于75%乙醇中浸泡10 min，然后将大鼠四肢剪下，放在含有75%乙醇的平皿中，超净工作台中剃去肌肉组织，剪去四肢长骨两端骨骺，反复吹打直至骨髓腔变白。将获得的细胞悬液离心、清洗并重悬，加到密度梯度离心液上方，离心后吸取中间层云雾状细胞，用PBS 清洗3 次，最后一次清洗完毕之后加入EGM-2 培养基诱导培养，5 d 后换液，以后每隔3 d 更换培养液。本实验采用晚期EPCs（3～4代细胞）作为研究对象。

待细胞传代至3 代以后，将细胞消化接种至24孔板中。将DiI-Ac-LDL 按5 mg/L 加入24 孔板中，置于37℃培养箱中孵育5 h，培养液吸出，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，按500 mg/L 加入FITCUEA-1置于37℃培养箱孵育2 h，PBS清洗，荧光显微镜下拍照。采用流式细胞术检测晚期EPCs 细胞表面标志物CD45、CD31、vWF及VEGFR2的表达。

2.2 实验分组 选取3～5 代的大鼠EPCs，分为：（1）LSS 组：施加12 dyn/cm2的LSS 处理细胞，检测相关指标；（2）LSS+pifithrin-α 组：在培养基中加入pifithrin-α（10 μmol/L）并施加12 dyn/cm2的LSS 处理细胞，检测相关指标。

2.3 LSS 的加载 LSS 系统（Flexcell）由蠕动泵、流室系统、储液瓶及导管组成。将细胞接种于用FN 打底的专用载玻片上，待细胞生长至80%左右将其放于无菌处理的流动腔系统中，连接装置。蠕动泵带动培养基构建层流剪切应力装置，通过计算机控制力学加载系统，设置12 dyn/cm2的LSS 作用于细胞。整个装置置于37℃、5%CO2的培养箱中。

2.4 Western blot实验 细胞经不同处理之后，取下载玻片，放在4 孔板中，PBS 洗2 次，将残余PBS 用吸水纸吸净；加入蛋白裂解液裂解细胞，蛋白收集完之后用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，进行蛋白定量。用5%浓缩胶以及10%的分离胶进行蛋白样品的分离，然后转移到硝酸纤维素膜上封闭，分别用抗pp53（1∶500，兔源）和p53（1∶1 000，兔源）、β-actin（1∶2 000，兔源）的Ⅰ抗孵育过夜，次日用1× TBST 洗5次，加入Ⅱ抗（1∶2 000，羊抗兔）孵育，在ECL 化学发光仪上显影并记录数据。

2.5 RT-qPCR 细胞经不同条件处理之后，用PBS洗2次，吸去残余液体，加入1 mL Trizol裂解细胞，提取总的RNA，逆转录成cDNA，再用RT-qPCR 法扩增相应的目的基因，将GAPDH 作为参照，引物序列见表1。以2-ΔΔCt公式计算相关基因的相对表达改变。

2.6 流式细胞术 胰酶消化收集细胞，PBS 洗2次，1 500 r/min 离心5 min，弃上清；加入抗CD31（或CD45）抗体室温孵育1 h，洗涤后加入荧光标记的Ⅱ抗，4℃避光孵育1 h，PBS再次洗涤后上机检测；vWF（或VEGFR2）染色时，先用4%多聚甲醛中固定10 min，离心，加入0.2%的吐温破膜，而后洗涤加入vWF（或VEGFR2）I 抗室温孵育1 h，加入荧光标记的Ⅱ抗，4℃孵育1 h，上机检测。

2.7 ELISA 检测 收集流槽系统中的上清，置于冻干机冻干20 h，取出冻干粉末，加2 mL 的培养基溶解，4℃、1 000×g 离心20 min，取上清检测，具体步骤按照大鼠血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）酶联免疫吸附测定试剂盒操作。

2.8 体外成管能力检测 将预冷24 h 的Matrigel基质胶按每孔80 μL 的量接种到96 孔板中，放置于37℃、5% CO2的培养箱中胶化1 h，将处理后的EPCs按每孔2×104的细胞量接种到已固化处理的基质胶上，显微镜下观察不同时点细胞体外成管形成情况。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 细胞迁移 胰酶消化细胞并制成细胞悬液，调整细胞密度至3×104。在Boyden 小室的下室加满培养液，中间放8 μm 滤膜，上室悬空滴加200 μL 细胞悬液，盖上盖玻片，将小室放于37℃、5% CO2的培养箱中培养8 h。取下滤膜，用棉签轻轻擦去上层未完全迁移的细胞，反向放置在12 孔板中，1×PBS 清洗，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI 染核15 min，避光保存，在荧光显微镜下观察拍照，计数细胞迁移量。

2.10 CCK-8 法检测细胞活力 将处理组的EPCs用胰酶消化，按每孔2×104细胞量加入96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，对数生长期时取出，加入CCK-8 检测缓冲液，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，在450 nm 处检测每孔的A 值，计算细胞活力。

2.11 EdU 染色法检测细胞增殖 将不同处理之后的细胞，消化制成细胞悬液，按每孔1×104个细胞量接种于96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞长至对数生长期时，按1∶1 000 的比例每孔加入100 μL 的EdU 溶液，培养2 h 后弃培养基，PBS 洗2 次，加入4%多聚甲醛固定液，固定30 min，弃固定液，每孔加入50 μL 的2 g/L 的甘氨酸，脱色摇床孵育5 min，弃甘氨酸溶液，PBS 清洗3 次，每孔加入100 μL 的0.5% Triton-X 孵育10 min，1×PBS 洗1次，每孔加入100 μL 的1× Apollo®染色反应液，避光孵育30 min，弃染色液，加入100 μL 的甲醇，清洗1～2 次，1×PBS 洗1 次，加入100 μL 的DAPI 染色液，避光染色15 min，弃染色液，1×PBS洗，荧光显微镜下观察并根据EdU 显色和细胞核荧光量，计算细胞增殖率。

2.12 细胞黏附的检测 经过不同处理的细胞消化，制成细胞悬液。按每孔2×104个细胞量加入12孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养30 min，取出后PBS洗3次，洗去未贴壁细胞，显微镜下拍照。

3 统计学处理

实验数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析。以上实验均独立重复3 次以上，实验数据使用均数±标准差（mean±SD）来表示，两组数据采用Student t检验分析，多组实验数据采用多因素方差分析（oneway ANOVA）处理数据，以P＜0.05 差异具有统计学意义。

结 果

1 EPCs的鉴定

晚期EPCs形态呈鹅卵石样或纺锤形（图1A），具有血管形成能力（图1B）；DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-1荧光染色后，呈染色双染阳性的细胞认为是正在分化的EPCs（图1C）。流式细胞术鉴定结果显示，晚期EPCs中CD31、vWF以及VEGFR2内皮标志分子表达呈阳性，CD45表达阴性（图1D）。

2 LSS对EPCs中p53及p-p53蛋白水平的影响

12 dyn/cm2的层流剪切应力作用于EPCs 后，Western blot 检测p-p53 和总p53 的蛋白水平。结果显示LSS 作用3 h 后，p53 总蛋白水平的差异无统计学显著性，6 h 与12 h 后总p53 蛋白表达量有明显升高（P＜0.01），见图2A。p-p53 蛋白水平在LSS 处理30 min 和1 h 后增加，在30 min 时升高最明显（P＜0.01），见图2B。

3 p53在层流剪切应力促EPCs分化中的作用

与单纯的LSS 相比，LSS+pifithrin-α 组内皮标志分子CD31 和vWF 的mRNA 表达降低（P＜0.01），见图3A。CD31 蛋白表达量较单纯LSS 组也明显下降，但流式细胞术分析结果显示LSS处理对EPCs上vWF蛋白的表达量无影响，见图3B。鉴于vWF 为分泌型蛋白，我们进一步检测了流槽液上清中vWF 的分泌情况，结果显示LSS+pifithrin-α组上清液中vWF较单纯LSS组明显降低（P＜0.01），见图3C。

4 p53在LSS对EPCs增殖及活性影响中的作用

Figure 1. Identification of late EPCs. A：the morphological changes of late EPCs（scale bar=200 μm）；B：the ability of tube forma⁃tion（scale bar=200 μm）；C：fluorescence staining of FITC-UEA-1 binding and DiI-Ac-LDL uptaking（scale bar=20 μm）；D：the expression of CD31，vWF，VEGFR2 and CD45 detected by flow cytometry.图1 晚期EPCs的鉴定

Figure 2. Effects of LSS on the protein levels of p-p53 and p53. A：effect of LSS on the protein levels of p53 at 0，3，6 and 12 h；B：effect of LSS on the protein levels of p-p53 at 0，10 min，30 min，1 h and 2 h. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs 0 h group.图2 LSS对p-p53以及p53蛋白水平的影响

与LSS 组相比，LSS+pifithrin-α 组的EdU 阳性率增高（P＜0.05），见图4A；CCK-8 细胞活力实验也显示，其细胞活力增加（图4B），与EdU 实验结果一致。以上检测结果均显示，LSS+pifithrin-α 组EPCs 的增殖活性高于单纯LSS组。

5 p53 在LSS 对EPCs 黏附、迁移和成管能力影响中的作用

EPCs 的黏附、迁移和成管是决定其内皮修复的基本能力。我们前期研究显示，LSS 可促进EPCs 黏附、迁移和体外成管能力。在本实验中我们发现，与LSS 组相比，LSS+pifithrin-α 组EPCs 的黏附（图5A）、迁移（图5B）和成管能力（图5C）均降低。

Figure 3. Role of p53 in differentiation of EPCs under LSS. A：the mRNA expression of CD31 and vWF after pretreatment with pifithrin-α under LSS；B：the protein expression of CD31 and vWF in EPCs treated with pifithrin-α under LSS；C：the pro⁃tein level of vWF in medium after pretreatment with pifithrin-α under LSS. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs static group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LSS group.图3 p53在LSS促EPCs分化中的作用

Figure 4. The effect of p53 on proliferation of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on proliferation of EPCs under LSS tested by EdU staining（scale bar=50 μm）；B：effect of pifithrin-α on viability of EPCs under LSS tested by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.图4 p53在LSS下对EPCs增殖的影响

讨 论

当血管发生损伤时，EPCs 通过骨髓动员到血液循环当中，进而趋化、黏附到损伤部位，并向内皮细胞分化，代替损伤或者发生凋亡的内皮细胞，参与受损血管内皮的修复［11］。文献表明，EPCs 存在2 种类型，分别为早期与晚期内皮祖细胞，早期EPCs 增殖能力较弱，以分泌功能为主，表达有干细胞标记分子，如CD133 等；而晚期EPCs 增殖能力较强，表达内皮标志分子VEGFR2、CD31 及vWF 等，并可受局部内环境影响，转化为成熟的内皮细胞，维持血管发生与血管生成。近期研究表明，EPCs 尤其是晚期EPCs 可作为心血管疾病中的内皮功能的标志物，并且在临床细胞移植治疗中具有广阔的前景［12］。

Figure 5. Effect of p53 on adhesion，migration and tube-forming ability of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on adhesion of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）；B：effect of pifithrin-α on migration ability of EPCs under LSS（scale bar=50 μm）；C：effect of pifithrin-α on tube formation of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.图5 p53在LSS下对EPCs黏附、迁移和成管能力的影响

剪切应力是血流在血管内皮表面流动所产生的物理应力，在调节内皮细胞众多重要蛋白的表达及调节血管内皮稳态中起着重要作用［13］。文献［8］及我们的前期实验结果表明［9，14］，剪切应力作为一种内在的物理因素，可以引起EPCs分化及功能改变，即LSS促进EPCs 向内皮分化（内皮标志分子表达增加），迁移，黏附以及血管生成能力增强，进而影响体内血管再内皮化。但也有实验表明，EPCs 在某些异常情况下，也可以向间质细胞进行转分化。我们前期的实验结果表明，振荡剪切应力（oscillating shear stress，OSS；模拟体内的扰动流）可以促进EPCs向间充质细胞转分化，提示EPCs 在不同环境中具有双向分化潜能。

在过去的40 年里，众多研究证实了p53 是强大的“基因组守护者”，而近年来研究显示，p53 还参与细胞代谢、表观遗传调控、细胞多能性维持、衰老调节，也有研究表明p53 的表达升高会对细胞起保护作用，故越来越多的数据显示p53 是一个全能的“细胞守护者”，而不仅仅是“基因组守护者”［15-16］。当细胞受到刺激时，p53 通过磷酸化、乙酰化及泛素化等翻译后修饰，从而导致一系列的反应。磷酸化是稳定p53 及增强其转录活性的重要因素，充当了快速打开以及关闭p53 功能的分子开关的角色［17］。部分实验数据显示，p53 还参与多种细胞的分化与转分化过程［18-19］。本研究中，我们对EPCs施加12 dyn/cm2的LSS，结果显示LSS 能够增加p-p53 及p53 总蛋白的水平。pifithrin-α 是一种p53 的阻断剂，也可降低核p53 的稳定性，抑制p53 依赖性的p53 应答基因的转录。本实验中使用p53 阻断剂pifithrin-α（10 μmol/L）阻断p53 的作用后，发现与LSS 组相比，LSS+pifithrin-α 组的EPCs 分化程度降低。内皮分化标记分子CD31 和vWF mRNA 表达较LSS 组明显降低；流式细胞术检测结果发现，虽然CD31 蛋白表达较LSS 组明显降低，与mRNA 表达的结果一致，但vWF蛋白变化的差异无统计学显著性。因为vWF为分泌型蛋白，我们进一步检测了上清中vWF的变化，ELISA 检测结果显示，LSS+pifithrin-α 组流槽液中vWF蛋白的分泌量与LSS组相比明显降低。

本实验结果显示，p53 在LSS 促内皮祖细胞分化中起着调控作用，抑制p53 功能后，LSS 引起的EPCs成血管、迁移及黏附能力下降，但其增殖能力增强，后者可能与p53 调控细胞衰老的机制相关［20］。结合我们近期研究，即扰动流剪切应力可以通过下调p53的表达促进EPCs 向间充质细胞转分化［21］，我们推测，p53 可能在EPCs 的分化与转分化中起到“分子开关”的作用，即p53 可以在LSS 作用下调节EPCs 的功能，促进EPCs 向内皮细胞转化，而在OSS 作用下促进EPCs向间质细胞分化。

综上所述，LSS 可能通过促进p53 的磷酸化，入核后发挥启动子的作用，促进EPCs 向内皮细胞分化，进而影响EPCs 各种功能。p53 分子生物学功能多样，本实验中p53 分子在入核后发挥的具体作用以及机制我们仍然不明确，目前正在进行深入研究。