NF-κB蛋白在柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡过程中的调控作用*

石哲玮， 秦铖璠， 钱彩珍， 蔡露铷， 刘胜新△

（1绍兴文理学院附属诸暨医院心血管内科，浙江诸暨311800；2温州医科大学，浙江温州325000；3绍兴文理学院，浙江绍兴312000）

病毒性心肌炎是指由于病毒感染引起的心肌组织炎症性病变［1］。多种病毒感染可导致病毒性心肌炎的发生，其中，柯萨奇病毒，同其他肠道小RNA 病毒一起导致了超过50%的急性心肌炎和大约25%的扩张型心肌病［2］。流行病学资料显示，心肌炎不仅是小于40 岁心衰患者的主要病因之一，而且也是年轻患者猝死的重要原因［3］。加深对病毒感染后心肌细胞死亡模式的研究有利于减少病毒性心肌炎患者的心肌损伤，改善病毒性心肌炎患者的远期预后。

细胞死亡模式可分为细胞非程序性死亡和程序性死亡两大类。非程序性死亡主要表现为细胞坏死，而程序性死亡主要包括凋亡、自噬、程序性坏死以及焦亡等［4］。细胞焦亡（pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是一种新发现的细胞死亡模式，主要表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，从而导致细胞内容物释放，最终激活强烈的炎症反应［5］。既往研究表明，细胞焦亡在包括支气管哮喘［6］、银屑病［7］和布鲁氏菌病［8］等炎症性疾病中均发挥重要作用，且细胞焦亡参与了阿霉素以及脂多糖诱导的心肌损伤过程［9-10］。Wang 等［11］的研究结果表明细胞焦亡存在于病毒性心肌炎疾病过程中，且柯萨病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）具有诱导心肌细胞焦亡的作用，通过调控组织蛋白酶B 抑制心肌细胞焦亡可改善病毒性心肌炎小鼠的预后。因此，加深对CVB3诱导的细胞焦亡过程的调控机制研究对于加深病毒性心肌炎疾病过程的认识具有参考价值。

为了证实CVB3 感染对心肌细胞焦亡的促进作用，阐明CVB3诱导心肌细胞焦亡可能的信号转导机制。本课题组在前期研究基础上，以CVB3嗜心肌株诱导的病毒性心肌炎小鼠作为研究对象，通过多种生物学手段证明CVB3 感染在诱导病毒性心肌炎小鼠心脏损伤中的作用及其对细胞焦亡相关蛋白表达水平的上调作用。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞与病毒株 Hep2 细胞采购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。CVB3 Nancy 株采购自ATCC。将CVB3 加入Hep2 细胞培养液中活化增殖，待CVB3 造成Hep2 细胞75%以上病理损伤时收获，测定并稀释其滴度至107TCID50/0.1 mL。

1.2 动物 健康清洁级雄性BALB/c 小鼠，4 至5 周龄，体重18至20 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证编号：SCXK（沪）2012-0002。本研究中所用雄性BALB/c 小鼠饲养于温州医科大学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（浙）2015-0009。

2 实验材料和仪器

NF-κB 抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrro⁃lidine dithiocarbamate，PDTC）购于Selleck；兔抗小鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、gasdermin D（GSDMD）、pro-caspase-1、caspase-1 和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligo⁃merization domain-like receptor protein 3，NLRP3）单克隆抗体均购于Abcam；兔抗小鼠p-NF-κB 和NF-κB单克隆抗体均购于CST；GAPDH 单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 均购于Bioworld；总RNA 提取试剂盒（东洋纺）以及CVB3、GAPDH 引物购于伯信生物公司；HE 染色试剂盒购于Solarbio；荧光定量PCR 仪购于Eppendorf；ELISA 检测试剂盒购于上海博谷生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 病毒性心肌炎动物模型构建及分组 在测定CVB3 病毒滴度后，向雄性BALB/c 小鼠腹腔内注射病毒稀释液制作病毒性心肌炎动物模型。采用随机数表法将45 只4～5 周龄的雄性BALB/c 小鼠平均分为3 组：正常组（normal 组）、病毒性心肌炎组（CVB3组）和NF-κB 蛋白抑制剂处理组（CVB3+PDTC 组），每组各15 只。除正常组外其余各组均通过腹腔接种1×106滴度的CVB3 病毒稀释液0.2 mL 构建病毒性心肌炎动物模型。由于柯萨奇病毒B 组作为一种嗜心肌病毒是病毒性心肌炎最为常见的致病原因，因此该模型构建方案已在本课题组前期研究中被广泛应用［12-13］。NF-κB 蛋白抑制剂处理组小鼠在腹腔接种CVB3 后给予NF-κB 蛋白抑制剂PDTC（100 mg·kg-1·d-1）腹腔注射处理。7 d后处死各组小鼠，并留取各组小鼠心肌组织和血清样本用于后续研究。本研究拟通过腹腔注射CVB3 明确病毒感染对心肌细胞焦亡的影响，通过抑制病毒性心肌炎小鼠体内NF-κB 蛋白表达水平阐明心肌细胞焦亡的信号转导机制。

3.2 生化指标检测 将正常对照组、病毒性心肌炎组和NF-κB 蛋白抑制剂处理组小鼠处死后立即开胸心脏取血，室温下放置1 h，待血液凝固后放入离心机中，4℃环境下1 120×g 离心10 min。离心后用移液器吸取离心管中的黄色上清液，按照ELISA 检测试剂盒中的操作步骤检测小鼠血清中脑钠肽（brain natriunetic pepide，BNP）和心肌钙蛋白I（cardiac tro⁃ponin I，cTnI）表达水平。

3.3 心肌组织形态学改变 切取部分心尖部心肌组织，用4%多聚甲醛固定24 h后清水洗去残留的多聚甲醛，按梯度脱水、石蜡包埋、石蜡固定等操作步骤制作组织蜡块。接着，通过石蜡切片机切取若干石蜡切片。然后，按照HE染色试剂盒中的实验步骤染色。最后，通过光学显微镜观察各心肌组织切片中炎症细胞浸润情况。邀请本院病理科医师对心肌组织炎症细胞浸润情况进行打分：无炎症细胞浸润为0分；炎症细胞浸润面积大于0且小于等于总面积的25%为1 分；大于25%且小于等于50%为2 分；大于50%且小于等于75%为3 分；大于75%且小于等于100%为4分。

3.4 RT-qPCR 实验检测 离心后根据说明书中的操作步骤用Trizol 法提取心肌组织内总RNA 并测定总RNA 的浓度及纯度，按东洋纺逆转录试剂盒说明书中的操作步骤合成cDNA，通过Eppendorf MAS 荧光定量PCR 分析系统进行检测，以GAPDH 为内参照，CVB3 mRNA 的相对含量以2-ΔΔCt表示，引物序列见表1。

3.5 Western blot 实验检测 称量剩余部分心肌组织的重量，并按一定比例配置蛋白裂解液连同心肌组织一起加入匀浆管中。使用匀浆机裂解心肌组织至糊状，冰上静置30 min，离心后用超声细胞破碎仪破碎细胞，再次放入离心机中12 000×g、4℃离心30 min。用移液器吸取上清液后通过BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，用10%分离胶分离蛋白后，在300 mA条件下转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Ⅰ抗（GAPDH 抗体1∶5 000 稀释，NF-κB、p-NF-κB、IL-1β、GSDMD、pro-caspase-1、caspase-1 和NLRP3 抗体均1∶1 000 稀释）中4℃孵育过夜，取出孵育盒用TBST 洗涤3 次后，Ⅱ抗孵育2 h，再次洗涤3 次，通过曝光机曝光各蛋白条带。用Image Lab 软件分析条带灰度值，IL-1β、GSDMD 和NLRP3 蛋白以GAPDH蛋白为参照，p-NF-κB 蛋白以NF-κB 蛋白为参照，caspase-1蛋白以pro-caspase-1蛋白为参照。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

4 统计学处理

用SPSS 22.0 统计软件进行分析。数据采用均数±标准差（mean±SD）表示。用Kaplan-Meier 法分析生存率；多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni 校正的t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠生存率改变

与对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠7 d 存活率显著降低（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制剂处理组小鼠7 d 存活率有所升高，但差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1. The survival rate of each group. Meas±SD. n=15. *P＜0.05 vs normal group.图1 各组小鼠的存活率

2 各组小鼠心肌组织内炎症细胞浸润情况

HE 染色结果表明，与对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织内存在大量炎症细胞浸润（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制剂处理组小鼠心肌组织内炎症细胞浸润程度显著降低（P＜0.05），见图2。

Figure 2. Morphological changes of cardiac tissues of mice in each group（HE staining，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.图2 抑制NF-κB蛋白磷酸化水平可减少心肌组织内炎症细胞浸润

3 各组小鼠心肌组织内CVB3扩增情况

RT-qPCR 实验结果表明，与对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织内CVB3 mRNA 表达水平显著增加（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组小鼠相比，NFκB 蛋白抑制剂处理组小鼠心肌组织内CVB3 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），见图3。

Figure 3. The mRNA expression level of CVB3 in cardiac tis⁃sues of mice in each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.图3 抑制NF-κB 蛋白磷酸化水平可降低心肌组织内CVB3的mRNA表达水平

4 各组小鼠血清中BNP和cTnI表达情况

ELISA 实验结果表明，与对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠血清中BNP 和cTnI 表达水平显著增加（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制剂处理组小鼠血清中BNP和cTnI表达水平显著降低（P＜0.05），见图4。

Figure 4. The serum levels of BNP（A）and cTnI（B）of mice in each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.图4 抑制NF-κB蛋白磷酸化水平可降低病毒性心肌炎小鼠血清中BNP和cTnI表达水平

5 各组小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白表达及NFκB蛋白磷酸化水平

Western blot实验结果表明，与对照组相比，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表达水平、caspase-1/pro-caspase-1比值以及NF-κB 蛋白磷酸化水平均显著升高（P＜0.05）；与病毒性心肌炎组小鼠相比，NF-κB 蛋白抑制剂处理组小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表达水平、caspase-1/pro-caspase-1比值以及NF-κB 蛋白磷酸化水平均显著降低（P＜0.05），见图5。

讨 论

Figure 5. The expression levels of IL-1β，GSDMD，NLRP3，caspase-1，pro-caspase-1，NF-κB and p-NF-κB in cardiac tissues of mice in each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs CVB3 group.图5 抑制NF-κB 蛋白磷酸化水平可下调心肌组织内焦亡相关蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表达水平、caspase-1/pro-cas⁃pase-1比值以及NF-κB蛋白磷酸化水平

病毒性心肌炎是一种病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，常可导致心肌细胞死亡和心功能恶化，最终导致心力衰竭的发生。在本研究中，本课题组探究了细胞焦亡这一新的细胞死亡模式是否存在于CVB3 诱导的病毒性心肌炎疾病过程中，并进一步阐明其在病毒性心肌炎小鼠体内的调控机制。本研究结果表明，细胞焦亡存在于病毒性心肌炎的发生发展过程中，且细胞焦亡受NF-κB 信号通路的调控，通过抑制细胞焦亡可以显著改善病毒性心肌炎小鼠的远期预后。

在心血管领域，细胞焦亡的研究主要集中在心肌梗死［14］和缺血再灌注损伤［15］等疾病中。细胞焦亡作为一种炎性细胞程序性死亡过程，在多种病原体诱导的炎症性疾病中同样发挥重要作用。既往研究表明肠病毒71 和CVB3 病毒均可诱导细胞焦亡的发生［16-17］。Yu 等［17］的研究结果表明钙蛋白酶可通过调控NLRP3/caspase-1 介导的经典焦亡途径和caspase-11 介导的非经典焦亡途径来影响CVB3 诱导的病毒性心肌炎。因此，本研究的主要目的是进一步验证病毒性心肌炎小鼠体内的细胞焦亡过程并探讨调控心肌细胞焦亡的信号转导机制。Western blot实验结果表明，CVB3感染后病毒性心肌炎小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白IL-1β、GSDMD 和NLRP3 表达水平显著上调，且caspase-1/pro-caspase-1 比值显著增加。由此可见，CVB3 作为一种肠病毒可诱导BALB/c 小鼠心肌损伤，同时可促进心肌组织内NLRP3/caspase-1 介导的心肌细胞焦亡的发生。由以上实验结果和文献资料我们推断，随着人们对病毒性心肌炎疾病过程研究的深入，CVB3 对心肌细胞的损伤作用将不仅仅局限于自噬和凋亡，而是会发掘更多新的细胞死亡模式，但其能否作为新的治疗靶点投入到临床中还需要深入研究。

为了进一步阐明病毒性心肌炎疾病过程中心肌细胞焦亡的信号转导机制。本研究通过给予病毒性心肌炎小鼠NF-κB 蛋白抑制剂处理，下调心肌组织内NF-κB 蛋白磷酸化水平。Wang 等［18］的研究表明，TLR4/NF-κB 信号通路可诱导GSDMD 介导的糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡改变；Liu 等［19］的研究表明，褪黑素可通过抑制小鼠脂肪组织中NF-κB/GSDMD 信号通路减轻细胞焦亡反应。本研究的Western blot 实验结果表明，给予NF-κB 蛋白抑制剂处理后小鼠心肌组织内焦亡相关蛋白IL-1β、GSDMD和NLRP3 表达水平显著降低，且caspase-1/pro-cas⁃pase-1 比值显著下调。由此可见，CVB3 诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌组织内的细胞焦亡过程受NF-κB蛋白磷酸化水平的调控，通过下调NF-κB 蛋白磷酸化水平可显著抑制心肌细胞焦亡反应，改善病毒性心肌炎小鼠的预后。本研究率先报道了NF-κB 信号通路在调控病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡中的作用，搭建起了炎症通路和细胞焦亡之间可能的联系，同时进一步加深了人们对于病毒性心肌炎疾病过程的认知。

综上所述，在本研究中我们再次验证了CVB3感染对心肌组织内焦亡相关蛋白表达水平的上调作用，且证明了通过给予病毒性心肌炎小鼠NF-κB 蛋白抑制剂处理可减少CVB3诱导的心肌损伤，同时下调心肌组织内焦亡相关蛋白表达水平，表明NF-κB信号通路可影响病毒性心肌炎小鼠心肌细胞焦亡程度。