支气管哮喘患儿急性期血清miR-218、CCL26表达及临床意义

肖雷 李兰兰 唐华 刘雅丽

支气管哮喘是目前影响儿童健康最常见的慢性呼吸系统疾病，可发生于各年龄组，在全球范围内发病率呈逐渐升高趋势[1]。支气管哮喘是一种由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的慢性非特异性炎症，以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征，临床症状有反复发作的咳嗽、喘息、气急以及胸闷等[2]。哮喘的发病因素及发生机制极其复杂，目前认为Th1型细胞与Th2型细胞之间数量和功能的失衡可能是哮喘发生的主要发病机制[3]。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA，长度约22个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3′-非编码区(UTR)结合在转录后水平负向调控基因的表达。大量研究表明miR-218在多种肿瘤组织中异常表达，引起人们关注[4]。有研究发现，miR-218在肺癌组织中呈低表达，miR-218可能通过抑制Robo1的表达，抑制肺癌细胞侵袭迁移[5]。而多项研究表明miR-218在慢性阻塞性肺炎患者肺组织或循环体液中一致性下调，表明miR-218与呼吸道疾病相关[6]。嗜酸性粒细胞趋化因子3(eosinophil chemotactic factor-3,eotaxin-3)又称CCL26，是CC型趋化因子中的一员，可被Th细胞分泌，是近年来发现的炎症反应调控分子，在过敏反应及炎性反应中具有重要作用[7]。有研究表明，在慢性鼻窦炎患者黏膜组织中eotaxin-3呈高表达，能够启动炎症因子的表达，诱导炎症反应级联放大[8]。miR-218与CCL26在儿童支气管哮喘中的研究较少，本研究探究了miR-218与CCL26在支气管哮喘急性期患儿血清中的表达及临床意义。

资料与方法

一、一般资料

选取2018年6月至2019年6月本院收治的支气管哮喘急性期患儿63例为观察组，男37例，女26例，年龄2～12岁，平均年龄(5.68±3.96)岁；入院复查的哮喘缓解期患儿22例为对照组，男15例，女7例，年龄2～12岁，平均年龄(5.32±3.14)岁。根据《支气管哮喘防治指南》[9]对哮喘急性期患儿病情严重程度进行分级，哮喘急性期轻度发作患儿25例为轻度组，中度发作患儿20例为中度组，重度发作患儿18例为重度组。观察组与对照组患者年龄、性别等一般资料差异无统计学意义，具有可比性(两组年龄比较t值为0.386、P值为0.701；两组性别比较卡方值为0.613、P值为0.434)。纳入标准：①所有患儿均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2008年修订的支气管哮喘诊治指南标准[9]；②年龄<14岁；③所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。排除标准：①过敏性疾病如系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病患儿；②近一个月内出现呼吸道感染者；③近三个月内应用糖皮质激素者。本研究经本院伦理委员会批准。

二、主要试剂与仪器

Trizol试剂(上海信帆生物科技有限公司，批号XF-P2960)、RNA逆转录试剂盒(K1622，Fermentas，MA，USA)、PCR试剂盒(Thermo Fisher)、引物(上海捷瑞公司合成)、人血清CCL26 酶联免疫(ELISA)试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司，货号：WK-SU00052)、白细胞介素-13(IL-13)ELISA试剂盒(上海群己生物有限公司，货号：KA3943)、IL-17、IgE ELISA试剂盒(上海歌凡生物科技有限公司，货号：HI029、HI079)；-80℃超低温冰箱(北京德馨永嘉科技有限公司)、实时荧光定量PCR仪(德国Roche公司，型号LightCycler 480 Ⅱ)。

三、研究方法

(1)样本的采集与保存

所有受试者于住院第二日清晨抽取空腹静脉血5 mL，以3 000 r/min离心15 min后分离血清，置于-80℃冰箱保存待测。

(2)qRT-PCR法检测血清miR-218水平

用Trizol法提取血清中总RNA，严格按照逆转录试剂盒说明书操作，将RNA逆转录为cDNA，采用2×SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，以cDNA为模板进行扩增。引物由上海捷瑞公司设计合成，引物序列(见表1)。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，63℃退火25 s，72℃延伸10 s，共进行42个循环。采用2-ΔΔCt法，以U6作为内参，计算miR-218相对表达量(见表1)。

表1 引物序列

(3)酶联免疫吸附法检测血清CCL26水平

采用上海瓦兰生物科技有限公司生产的CCL26 ELISA试剂盒，严格按照ELISA试剂盒说明书进行加样、加酶标抗体、温育、洗涤、显色、终止，测定受试者血清中CCL26的浓度3次，取平均值。

(4)观察指标

采用IL-10、IL-13、IL-17、IgE试剂盒，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，测定受试者血清中IL-10、IL-13、IL-17、IgE浓度。

采用肺功能检测仪(德国JAEGER公司，型号：Master Scope Diffusion)对受试者肺功能进行检测，得到1s用力呼气量(FEV1)及呼气峰流速(PEF)，指标以实测值占预计值百分比表示。

四、统计学分析方法

结 果

一、两组患儿血清miR-218、CCL26表达水平比较

与对照组相比，观察组患儿血清中miR-218水平显著降低(P<0.05)；血清CCL26水平显著升高(P<0.05)(见表2)。

表2 两组miR-218、CCL26表达水平比较

二、两组患儿血清中相关炎性因子水平比较

与对照组相比，观察组患儿IL-13、IL-17、IgE表达显著升高(P<0.05)；FEV1、PEF水平显著降低(P<0.05)(见表3)。

表3 两组患儿血清中相关炎性因子水平比较

三、不同严重程度患儿血清中miR-218、CCL26表达水平比较

与轻度组相比，中度组、重度组患儿血清miR-218水平显著降低，CCL26水平显著升高(P<0.05)；与中度组相比，重度组患儿血清miR-218水平显著降低，CCL26水平显著升高(P<0.05)(见表4)。

表4 不同严重程度患儿血清中miR-218、CCL26表达水平比较

四、血清miR-218、CCL26表达水平相关性分析

结果显示，miR-218与CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈负相关(r=-0.614、-0.610、-0.678、-0.498，P<0.05)，与FEV1、PEF呈正相关(r=0.680、0.643，P<0.05)；CCL26与FEV1、PEF呈负相关(r=-0.659、-0.714，P<0.05)，与IL-13、IL-17、IgE呈正相关(r=0.529、0.635、0.522，P<0.05)(见表5)。

表5 血清miR-218、CCL26水平与炎症因子相关关系

讨 论

支气管哮喘是儿童时期最常见的慢性疾病，近年来，随着环境污染日益严重，支气管哮喘的患病率和死亡率快速增加[10]。目前对其发病机制尚未完全了解，可能的发病机制有免疫学机制、遗传学和环境因素、神经受体调节机制、呼吸道感染等[11]。既往学者认为Th1/Th2细胞功能失调是支气管哮喘的主要发病机制，免疫功能下降，外源性致敏原被抗原递呈细胞吞噬并激活T细胞，产生大量炎性因子及多种活性物质，导致气道平滑肌收缩剂，气道壁细胞分泌物增多，引发临床症状，免疫功能下降亦可活化辅助性Th2细胞，激活免疫细胞聚集，吞噬炎性细胞，同时释放出多种炎性介质、细胞因子等[12]。

miR-218由miR-218-1和miR-218-2两基因编码，分别位于染色体4p15.2及5q34-35[13]。研究发现，miR-218靶基因主要富集在生物学调控、蛋白代谢、细胞迁移和黏附、细胞分化等生物学过程，以及蛋白结合、连接酶活性等分子功能中[14]。miR-218在子宫颈癌和头颈部肿瘤中的研究结果显示，肿瘤细胞转染miR-218后LAMB3表达下降，通过siRNA抑制LAMB3表达，细胞的生长、侵袭转移能力受到抑制[15]。有研究发现miR-218在急性淋巴白血病T淋巴细胞中表达下调，可通过负性调节KIT蛋白的表达，并抑制急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞的细胞增殖，促进凋亡[16]。miR-218在支气管哮喘中的研究较少，本实验结果显示，与支气管哮喘缓解期患儿相比，急性期患儿血清中miR-218水平显著降低，提示miR-218可能与支气管哮喘急性期有关。且随急性期患儿病情严重程度的增加，血清miR-218表达水平呈逐渐下降趋势，提示血清miR-218与支气管哮喘急性期发病的过程相关。

CCL26位于23染色体上的7q11.含有3个外显子，由77个氨基酸构成，可与CCR3受体结合[17]。目前认为嗜酸性粒细胞(EOS)是哮喘气道炎症发生的主要效应细胞，而有研究表明，在体外CCL26对嗜酸性粒细胞具有趋化作用[18]。CC趋化因子不仅局部趋化作用，免疫调节、抗病毒免疫、调节细胞代谢，同时还能够促进释放组胺参与过敏反应[19]。已有研究表明，哮喘患者支气管黏膜中CCL26表达明显增高，而在患者血清中的表达少有研究。本研究结果显示，CCL26在支气管哮喘急性期患儿血清中呈高表达，提示CCL26与支气管哮喘急性期的发病有关。且随支气管哮喘急性期患儿病情严重程度的增加，CCL26水平呈逐渐升高趋势，提示血清CCL26与支气管哮喘急性期的病情发展有关，能够一定程度反应患儿病情严重程度。另对患儿血清中炎症因子及肺功能进行检测，IL-13、IL-17是细胞免疫中的重要细胞因子，IgE属于IL13下游因子，属于Th2型细胞因子，且与嗜酸性粒细胞浸润关系密切；FEV1和PEF是评价支气管哮喘严重程度和疗效的重要指标，可以反映患者的气流受限程度，支气管哮喘发作时其水平降低，与支气管哮喘严重程度具有良好的正相关性[20]。结果显示，支气管哮喘急性期患儿血清中炎性因子IL-13、IL-17、IgE呈高表达，肺功能FEV1、PEF显著低于缓解期患儿。提示血清中炎性因子过表达与支气管哮喘急性期发病有紧密联系，急性期患儿炎症反应显著高于缓解期患儿；急性期患儿肺功能显著下降，支气管哮喘发作对患儿肺功能影响显著。而相关性分析显示，血清miR-218与CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈负相关，与FEV1、PEF呈正相关；CCL26与FEV1、PEF呈负相关，与IL-13、IL-17、IgE呈正相关。提示血清miR-218可能通过介导炎性反应，影响支气管哮喘患儿肺功能及病情严重程度；CCL26可能在嗜酸性粒细胞的黏附、募集和脱颗粒中发挥重要作用[21]。

综上所述，在支气管哮喘急性期患儿血清中miR-218呈低表达，CCL26、IL-13、IL-17、IgE呈高表达。支气管哮喘急性期患儿FEV1、PEF水平显著低于缓解期患儿。