添加沙葱与发酵剂对发酵羊肉干中亚硝胺的抑制作用

刘建林，赵丽华，孙学颖，王 丹，张晓蓉，杨 帆

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010020 2 鄂尔多斯生态环境职业学院 内蒙古鄂尔多斯017000）

发酵肉制品是目前广大消费者喜爱的肉制品之一。由于亚硝酸盐具有护色、防腐、抗氧化以及形成特有风味等作用，已成为发酵肉制品生产过程中必不可少的添加剂。然而，在生产流通过程中，亚硝酸盐可与胺类物质形成强致癌物N-亚硝胺[1]。过量N-亚硝胺的存在不仅影响食品的风味，而且具有致癌性、致畸性以及致突变性，会对人体造成极大的危害[2]。发酵肉制品中亚硝胺控制的研究主要集中在前体物质控制（亚硝酸盐和生物按）、香辛料阻断以及辐照、生物降解等方面。添加香辛料以及发酵剂是目前控制发酵肉制品中亚硝胺含量最安全、最有效并值得研究的2 种方法[2-3]。

向发酵肉制品中接种具有降解亚硝胺能力的微生物，不仅可以抑制亚硝胺的形成，缩短发酵肉制品的成熟期，延长货架保质期，还能促进发酵肉制品中蛋白质和脂肪的分解，生成氨基酸、肽和挥发性脂肪酸等，促进风味的形成。添加天然香辛料不仅对发酵肉制品中亚硝酸盐和亚硝胺的形成有一定清除和阻断能力，而且可以促进发酵肉制品中风味的形成[4-5]。Liao 等[6]将植物乳杆菌120、酿酒酵母2018 和木糖葡萄球菌135 接种于中国传统发酵鱼类产品上，发现3 株菌株均能直接降解N-亚硝基二甲胺（NDMA），使其含量显著低于未经处理的传统发酵样品，其中植物乳杆菌120 的降解率最高。Mah 等[7]将大蒜等香辛料加入韩国腌凤尾鱼和发酵凤尾鱼中，结果表明大蒜提取物可通过抑制生物按的形成，进而控制亚硝胺的生成。

本研究将实验室筛选出的植物乳杆菌X3-2B和天然香辛料沙葱添加到发酵羊肉干中，研究其对羊肉干发酵过程中亚硝胺含量、理化指标（pH值、水分活度、色差）以及亚硝酸盐残留量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

背最长脊羊肉，巴盟察右中旗放牧羊；食盐，中国盐业集团有限公司；白砂糖，太古糖业（中国）有限公司；葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸钠和氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；亚硝胺混标，美国Sigma 公司；甲醇，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；植物乳杆菌X3-2B，内蒙古农业大学微生物实验室提供；沙葱，购于鄂尔多斯市；亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、盐酸，国药集团化学试剂有限公司；乙酸锌、硼砂钠，天津市风船化学试剂科技有限公司。以上试剂中所用水为超纯水，甲醇为色谱纯级，其余为分析纯级试剂。

电子天平（BS210S），北京赛多利斯仪器系统有限公司；水分活度仪（Lab Master-a），瑞士NOVASINA 公司；全自动测色色差计（TCP 2），北京奥依克仪器有限公司；UV-1800 型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；高效液相色谱仪（Agilent 1260vwd），美国Agilent Technologies 公司；电热恒温培养箱（DHP-9802），上海一恒科学仪器有限公司；数显式恒温水浴锅（HH-6），国华电器有限公司；恒温恒湿箱（ZXMP-A 1430），上海智城分析仪器制造有限公司；多头磁力加热搅拌器（HJ-6），江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；pH 计（pH 400），安莱立思仪器科技（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵羊肉干的制作 将原料肉去除筋腱、筋腱膜和脂肪后，顺着肌纤维将羊肉切成长为2～3 cm 的条。加入辅料后将处理好的发酵剂菌液加入到羊肉条中，使其终含量在羊肉条中达到107CFU/g。将羊肉条与辅料、菌液等混合均匀后进行腌制，腌制12 h 后发酵。具体试验分组及辅料添加量见表1。

表1 发酵羊肉干配方及分组情况Table 1 Recipe and grouping of fermented dried mutton

1.2.2 试验设计共制作4 组发酵羊肉干（对照组、发酵剂组、沙葱组、沙葱+发酵剂组），在4 个阶段（0 d 腌制、2 d 发酵、5 d 干燥、6 d 成熟）取样，检测各项指标。

1.2.3 pH 值的测定 将样品切碎并准确称取2.50 g 于50 mL 锥形瓶中，加入22.5 mL 蒸馏水，加入磁性转子，于多头磁力加热搅拌器搅拌振荡10 min 后用pH 计测定pH 值。

1.2.4 水分活度（aw）的测定 将取得的样品切成细小而均匀的碎块，铺满整个水分活度仪样品盒后测定。

1.2.5 色差的测定将样品切成细小而均匀的颗粒状，肥肉和瘦肉均匀平铺于色差测定专用器皿中，使用TCP 全自动色差计测定色差。

1.2.6 亚硝酸盐、亚硝胺含量的测定 亚硝酸盐含量测定参照GB 5009.33-2016[8]进行。亚硝胺含量测定参照温演庆等[9]的方法进行。

1.3 统计分析

数据采用SPSS 8.0 软件分析，平均值采用Duncan 法进行多重比较，结果表示为平均值±平均标准差（SD），每个试验重复3 次。统计学显著分析P＜0.05 表示差异性显著，P＜0.01 表示差异性极显著[10]。采用Excel 软件作图。

2 结果与讨论

2.1 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中pH值的影响

如图1所示，腌制结束到发酵结束（0～2 d），各组羊肉干的pH 值迅速下降（P＜0.05），此阶段为产酸主要阶段。发酵结束后进入干燥期（2～5 d），各组pH 值开始回升（P＜0.05），可能是因为代谢物有机酸的积累抑制了产酸的进行。同时，微生物代谢产生的一些碱性物质，如氨和三甲胺也会阻碍pH 值的降低[11]。进入成熟阶段后，各组pH 值有缓慢下降的趋势（P＜0.05），而发酵剂组的pH 值仍呈上升趋势。

对比试验组，对照组的pH 值下降较缓慢，这可能是由于发酵过程中，对照组的乳酸菌数量较少且生长缓慢，此时蛋白酶降解肉中的非蛋白氮[12]，从而使pH 值下降较缓慢。添加沙葱和发酵剂组的pH 值在发酵过程中迅速下降（P＜0.05），且都降到5.3 以下，这是因为试验组在发酵过程中添加的纯菌为优势菌并大量繁殖，添加的天然香辛料能促进乳酸菌的生长，而乳酸菌代谢产生的碳水化合物，尤其是乳酸可使pH 值降低[4]。较低的pH 值环境有助于抑制致病菌和腐败菌的生长[13-14]，从而增加制品的食用安全性。发酵羊肉干成熟后才可正常食用，后期pH 值的回升为发酵羊肉干增添适合食用的口感，而无酸涩的口感[15]。

2.2 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中aw的影响

低水分活度是栅栏技术中的关键因子，是发酵产品货架期和食用安全的一个重要因素，低水分活度可有效抑制发酵香肠中的腐败菌和致病菌的生长，还可以抑制氨基酸脱羧酶的活性，从而控制生物胺的形成[16]。在发酵过程中，各组aw值在0.94～0.95 之间（图2），无显著性差异（P＞0.05）。进入干燥阶段，由于工艺条件的变化，aw降至0.77～0.84 之间。当水分活度达到0.88 以下时，发酵肉干符合规定标准，事实上低水分活度可以使得许多酶的活性受到抑制[17]。

2.3 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中色差值的影响

肉色是肉及其产品外观评定的重要指标。通过测定样品的亮度L*、红度a*、黄度b*得出e 值，从而反映发酵羊肉干在制作过程中色差的变化情况。在发酵肉制品中影响反应色泽最关键的因素是红度a*，而黄度b*、亮度L*对色泽也有一定的影响。参照方梦琳[18]的方法，引用e 值对发酵羊肉干的色泽进行评价，计算公式：e=a*/L*+a*/b*。4 组样品各阶段的e 值变化趋势如图3d所示。与对照组相比，试验组e 值在发酵开始时呈上升趋势（P＜0.05），说明腌制后亚硝酸盐开始发挥作用，在发酵剂和沙葱的作用下逐渐将NaNO2转变为NO，与瘦肉中的肌红蛋白结合形成鲜红色的一氧化氮肌红蛋白，使得红值较高[19]。成熟过程中，各组e值显著下降（P＜0.05），只有沙葱+发酵剂组e 值开始上升，说明发酵剂和沙葱开始共同作用，猜测是沙葱中的某种活性物质促进了乳酸菌的生长，使得产品色泽达到最好[20]。

图1 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中pH 值的影响Fig.1 Effect of scallion and starter on pH value of fermented lamb jerky during production

图2 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中aw 的影响Fig.2 Effects of scallion and starter on the aw of fermented lamb jerky during production

图3 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中L*（a）、a*（b）、b*（c）和e（d）值的影响Fig.3 Effects of scallion and starter on the L*（a），a*（b），b*（c）and e（d）value of fermented lamb jerky during production

2.4 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中亚硝酸盐含量的影响

亚硝酸盐可与脂肪、蛋白质等反应，不仅具有呈色、发色，增强肉制品风味的作用，还可抑制肉制品脂肪氧化，提高肉制品稳定性。在腌制过程中，亚硝酸盐可在很大程度上抑制肉毒杆菌的生长[21]。如图4所示，腌制过程中各组亚硝酸盐含量达到最高（P＜0.05），进入发酵、干燥阶段后，各组亚硝酸盐含量明显下降（P＜0.05），说明是具有亚硝酸盐还原酶菌株的活跃时期[22]。亚硝酸盐在此阶段逐渐转变为NO 发挥呈色等作用。成熟结束后，沙葱+发酵剂组的亚硝酸盐残留量明显高于其它组（P＜0.05），其色泽也优于其它组。亚硝酸盐是强致癌物N-亚硝胺的前体物质，亚硝酸盐的残留使其与胺类物质反应形成强致癌性的亚硝基化合物。

2.5 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中亚硝胺含量的影响

N-亚硝基二甲胺（NDMA）和N-亚硝基吗啉（NMOR）的含量整体呈下降趋势（图5a 和5b）。在腌制结束后（0 d）2 种亚硝胺的含量较高，可能是由于初始加入的硝酸盐和亚硝酸盐含量较高，其与胺相互作用所致[23]。发酵结束后（0～2 d），各组发酵羊肉干中N-亚硝基二甲胺的含量逐渐下降，含有植物乳杆菌的2 组样品中NDMA 和NMOR 的含量明显低于对照组和沙葱组（P＜0.05），说明添加植物乳杆菌可以降低NDMA 和NMOR 的含量，可能是因为发酵阶段优势菌群迅速生长，使得pH值最低。成熟结束后（5～6 d），沙葱+发酵剂组NDMA 和NMOR 的含量明显低于其它3 组（P＜0.05），说明共同添加沙葱和发酵剂时对发酵羊肉干中NDMA 和NMOR 2 种亚硝胺的降解效果最好，与本研究结果类似。Liao 等[6]研究发现将植物乳杆菌120 接种于中国传统发酵鱼类产品上，可显著降低样品中NDMA 的含量。

图4 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中亚硝酸盐含量的影响Fig.4 Effects of scallion and starter on the nitrite content of fermented lamb jerky during production

亚硝基二乙胺（NDEA）是发酵肉制品中较常见的一种胺类物质。由图5c 可知，整个制作过程中，各组NDEA 的含量整体呈上升趋势，变化不显著（P＞0.05），说明添加植物乳杆菌和沙葱对NDEA 的积累影响较小。成熟结束后（5～6 d），试验组NDEA 的含量显著低于对照组（P＜0.05），而且沙葱+发酵剂组的含量最低。

N-亚硝基吡咯（NPYR）和N-亚硝基二正丙胺（NDPA）的含量整体呈先上升后下降的趋势（图5d 和5e），且在干燥结束后（2～5 d）各组NPYR 和NDPA 的含量达到最高值，说明此阶段为NPYR和NDPA 的形成提供了适宜的条件（如合适的pH值和aw等）。然而，在成熟结束后（5～6 d），各组NPYR 和NDPA 的含量显著降低（P＜0.05），说明此阶段环境的改变抑制了2 种亚硝胺的积累。

图5 沙葱与发酵剂对发酵羊肉干制作过程中亚硝胺含量的影响Fig.5 Effects of scallion and starter on the nitrosamines of fermented lamb jerky during production

N-亚硝基哌啶（NPIP）和N-亚硝基二正丁胺（NDBA）含量整体呈上升趋势（图5f 和5g）。在腌制结束后（0 d）对照组和试验组NPIP 和NDBA 的含量都很低，随着发酵羊肉干制作过程的进行，2种亚硝胺的含量逐渐上升，说明NPIP 和NDBA 2种亚硝胺是在肉干制作过程中逐渐形成的，添加发酵剂对NPIP 和NDBA 的积累没有抑制作用。在成熟结束后（5～6 d），沙葱+发酵剂组NPIP 和NDBA 2 种亚硝胺含量明显低于其它3 组（P＜0.05），说明同时添加沙葱和发酵剂的效果优于单独添加发酵剂和沙葱。与本研究类似，Sun 等[24]研究发现在哈尔滨风干肠中接种戊糖乳杆菌和米酒乳杆菌，对NPIP 的生成没有显著的抑制作用。

综上所述，在发酵羊肉干中同时加入沙葱和发酵剂，可显著抑制7 种亚硝胺的积累，确保发酵羊肉干的质量安全。

3 结论

同时添加沙葱和植物乳杆菌 X3-2B 可显著降低发酵羊肉干中亚硝胺（N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基吡咯、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基二正丁胺）的积累，促进发酵羊肉干pH 值和水分活度的降低，抑制致病菌和腐败菌的生长，缩短发酵周期，延长产品的货架保质期，进而提高发酵羊肉干的产品稳定性。沙葱和植物乳杆菌X3-2B 还在减少亚硝酸盐残留量的同时，改善发酵羊肉干的色泽。将沙葱与发酵剂共同应用到发酵羊肉干的生产中，既可抑制发酵羊肉干中亚硝胺的积累，又可改善发酵羊肉干的色泽，增加消费者的购买欲。