Ce3+、VC和Ac-DEVD-CHO浸种对沙葱种子抗氧化系统的影响

王佳琪，李 娜，魏鹏超，杨忠仁，3，张 东，张凤兰，3

种子是种子植物的生殖器官，也是农业生产中最基础的生产材料。种子在成熟后，会随着贮藏时间的延长逐渐老化直至失去活力，这一过程是不可逆的。种子老化主要表现为质膜完整性降低、保护酶系统活性下降、有毒物质积累[1]。沙葱（Allium mongolicum Regel.）为百合科（Liliaceae）葱属（Allium L.）多年生草本植物[2]，具有独特的辛辣味，营养成分丰富，被誉为“菜中灵芝”，可炒食、焯水后凉拌、烹调拌馅，亦可腌渍或干制。沙葱种子萌发后可作为芽菜开发利用[3]，种子还可作调味佐料，沙葱籽油是一种很好的保健油[4]。在沙葱种子贮藏过程中发现其易发生老化劣变，种子寿命缩短，严重影响了沙葱的开发利用和种质资源的保存。因此，探究缓解沙葱种子老化和提高种子活力的方法对于减少种质资源浪费的研究具有重大意义。

我国稀土资源丰富，是世界稀土储存量最多的国家，我国开始“稀土农用”研究始于20 世纪70年代初。有研究证明，适宜浓度的稀土元素能够提高植物种子活力和抗氧化酶活性[5-6]、降低活性氧和MDA含量[7]，会对植物体内Ca2+水平起替代作用[8]，并会对营养成分的吸收[9]、细胞超微结构[10]、光合作用和抗逆性产生影响[11-12]。在稀土中，元素丰度排在第一的为Ce[13]。抗坏血酸（VC）是一种重要的小分子活性物质，主要参与生命体内的物质代谢和氧化还原反应[14]，有降低活性氧（ROS）、提高抗氧化酶活性和降低MDA 含量的作用[15]。半胱氨酸酶家族是细胞凋亡的主要执行者，半胱氨酸-3 酶（caspase-3 酶）的活化会诱导植物细胞程序性死亡。GE 等[16]研究发现，用Ac-DEVD-CHO 处理东北红豆杉细胞能够抑制caspase-3 酶活性，从而达到降低细胞凋亡率的目的，因此提出·O2-激活caspase-3 酶导致细胞凋亡的研究结论。

为了研究Ce3+、VC 和Ac-DEVD-CHO 对沙葱种子抗氧化酶活性的影响及对其有害物质的抑制作用，本试验选用CeCl3、VC 和Ac-DEVD-CHO 3 种物质对不同贮藏年限自然老化的沙葱种子进行浸种处理，并对处理后沙葱种子的抗氧化酶活性和有害物质进行分析，旨在为缓解沙葱种子老化及有效保存其种质资源提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以采自毛乌素沙地且贮藏3年、5年和7年的沙葱种子为试验材料。

1.2 试验处理

沙葱种子经2% NaClO 消毒10 min，用蒸馏水冲洗4 次后进行试验。本试验的影响因素为不同的浸种溶液，以蒸馏水浸种为对照（CK），其他不同处理的浸种溶液分别为400 mg/L CeCl3、400 mg/L VC、100 μmol/L Ac-DEVD-CHO 以及VC+CeCl3、Ac-DEVD-CHO+CeCl3。不同处理对沙葱种子浸种方法如下：蒸馏水（CK）、CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO处理的浸种方法为直接将沙葱种子浸种6 h。VC+CeCl3、Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理的浸种方法为分别用浓度为400 mg/L VC 和100 μmol/L Ac-DEVD-CHO浸种6 h，再用400 mg/L CeCl3浸种6 h。使用6 个不同处理的方法分别对贮藏3年、5年和7年沙葱种子进行浸种，每处理4 次重复，每重复0.2 g 种子，浸种溶液体积为3 mL。

1.3 生理指标的测定

分别对不同贮藏年限、不同浸种处理的沙葱种子进行抗氧化酶活性和有害物质含量的测定，其中，SOD 活性、POD 活性、CAT 活性、·O2-产生速率、H2O2含量和MDA 含量的测定参照李合生[17]的方法；APX活性的测定参照NAKANO 等[18]的方法。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010 软件进行数据的统计与作图，SAS 9.0 统计学软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浸种处理对沙葱种子抗氧化酶活性的影响

2.1.1 不同浸种处理对沙葱种子SOD 活性的影响 由图1 可知，随着贮藏年限的延长，对照（CK）和CeCl3处理沙葱种子的SOD 活性呈下降趋势；VC和VC+CeCl3处理沙葱种子的SOD 活性呈先降低后升高的趋势；Ac-DEVD-CHO 处理沙葱种子的SOD活性呈先升高后降低的趋势；Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的SOD 活性呈上升趋势。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子SOD 活性的影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经VC、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，SOD 活性均低于CK，其中，VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理的SOD 活性与CK 相比差异显著（P＜0.05）；经CeCl3处理后，SOD 活性高于CK，但二者差异不显著（P＞0.05）。贮藏5年的沙葱种子经CeCl3和Ac-DEVD-CHO 处理后，SOD 活性显著高于CK（P＜0.05）；经VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，SOD 活性显著低于CK（P＜0.05）。贮藏7年的沙葱种子经CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3处理后，SOD 活性均高于CK，其中，CeCl3和Ac-DEVD-CHO 处理的SOD 活性与CK 相比差异显著（P＜0.05）；经Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，SOD 活性低于CK，但二者差异不显著（P＞0.05）。

图1 不同浸种处理对沙葱种子SOD 活性的影响

2.1.2 不同浸种处理对沙葱种子POD 活性的影响 由图2 可知，随着贮藏年限的延长，CK 和VC处理沙葱种子的POD 活性呈先升高后降低的趋势，CeCl3、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的POD 活性呈下降趋势。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子POD 活性的影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经不同浸种处理后，POD 活性均显著高于CK（P＜0.05）；VC 处理的POD 活性显著低于CeCl3、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理（P＜0.05）；CeCl3、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理差异不显著（P＞0.05）。贮藏5年的沙葱种子经不同浸种处理后，POD 活性与CK 相比差异不显著（P＞0.05），但Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理的POD 活性显著低于CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3处理（P＜0.05）。贮藏7年的沙葱种子经CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3处理后，POD活性显著高于CK 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理（P＜0.05）；CeCl3处理的POD 活性显著低于VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3处理（P＜0.05）；VC、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3处理差异不显著（P＞0.05）。不同浸种处理对提高贮藏3年沙葱种子POD 活性的效果更好。

图2 不同浸种处理对沙葱种子POD 活性的影响

2.1.3 不同浸种处理对沙葱种子CAT 活性的影响 由图3 可知，随着贮藏年限的延长，CK、VC 和VC+CeCl3处理沙葱种子的CAT 活性变化不大；CeCl3处理沙葱种子的CAT 活性呈上升趋势；Ac-DEVD-CHO 处理沙葱种子的CAT 活性呈先升高后降低的趋势；Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的CAT 活性呈先降低后升高的趋势。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子CAT 活性的影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经不同处理后，CAT活性与CK 相比差异均不显著（P＞0.05）；贮藏5年的沙葱种子经Ac-DEVD-CHO 处理后，CAT 活性显著高于CK（P＜0.05），其他浸种处理与CK 相比差异不显著（P＞0.05）；贮藏7年的沙葱种子经CeCl3、Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，CAT 活性显著高于CK（P＜0.05），且Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理显著高于CeCl3、Ac-DEVD-CHO 处理（P＜0.05）。

图3 不同浸种处理对沙葱种子CAT 活性的影响

2.1.4 不同浸种处理对沙葱种子APX 活性的影响 由图4 可知，随着贮藏年限的延长，CK、VC 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的APX 活性呈下降趋势；CeCl3和VC+CeCl3处理沙葱种子的APX 活性呈先升高后降低的趋势；Ac-DEVD-CHO处理沙葱种子的APX 活性呈上升趋势。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子APX 活性的影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经Ac-DEVD-CHO 处理后，APX 活性显著低于CK 和其他处理（P＜0.05）；CeCl3、VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理的APX 活性与CK 相比差异不显著（P＞0.05）。贮藏5年的沙葱种子经CeCl3处理后，APX 活性显著高于CK 和其他处理（P＜0.05）；Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理的APX 活性显著低于CK（P＜0.05）。贮藏7年的沙葱种子经不同浸种处理后，APX 活性均显著高于CK（P＜0.05），其中，CeCl3和Ac-DEVD-CHO 处理的APX 活性又显著高于VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理（P＜0.05），但二者差异不显著（P＞0.05）。

图4 不同浸种处理对沙葱种子APX 活性的影响

2.2 不同浸种处理对沙葱种子有害物质的影响

2.2.1 不同浸种处理对沙葱种子·O2-产生速率的影响 由图5 可知，随着贮藏年限的延长，CK、VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3处理沙葱种子的·O2-产生速率呈上升趋势；CeCl3处理沙葱种子的·O2-产生速率呈先升高后降低的趋势；Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的·O2-产生速率整体变化不明显。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子·O2-产生速率的影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，·O2-产生速率显著低于CK（P＜0.05），Ac-DEVD-CHO 处理沙葱种子的·O2-产生速率显著高于CK（P＜0.05）；贮藏5年和7年的沙葱种子经CeCl3、VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，·O2-产生速率显著低于CK（P＜0.05）。从整体来看，VC 和Ac-DEVD-CHO与CeCl3共同处理对清除沙葱种子·O2-产生速率的效果更好。

图5 不同浸种处理对沙葱种子·O2-产生速率的影响

2.2.2 不同浸种处理对沙葱种子H2O2含量的影响 由图6 可知，随着贮藏年限的延长，CK、CeCl3处理沙葱种子的H2O2含量呈上升趋势；VC 和VC+CeCl3处理沙葱种子的H2O2含量呈下降趋势；Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的H2O2含量整体变化不大。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子H2O2含量影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经CeCl3和VC+CeCl3处理后，H2O2含量显著高于CK（P＜0.05），其他处理沙葱种子的H2O2含量与CK 相比差异不显著（P＞0.05）。贮藏5年的沙葱种子经VC、Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理后，H2O2含量显著低于CK（P＜0.05）；CeCl3和VC+CeCl3处理的H2O2含量显著高于CK（P＜0.05）。贮藏7年的沙葱种子经CeCl3处理后，H2O2含量显著高于CK（P＜0.05），其他浸种处理H2O2含量显著低于CK（P＜0.05）。

图6 不同浸种处理对沙葱种子H2O2 含量的影响

2.2.3 不同浸种处理对沙葱种子MDA 含量的影响 由图7 可知，随着贮藏年限的延长，CK、VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理沙葱种子的MDA 含量呈上升趋势；CeCl3和Ac-DEVD-CHO处理沙葱种子的MDA 含量整体变化不明显。不同浸种处理对不同贮藏年限沙葱种子MDA 含量影响存在差异。贮藏3年的沙葱种子经Ac-DEVD-CHO和VC+CeCl3处理后，MDA 含量显著高于CK（P＜0.05），其他浸种处理与CK 相比差异不显著（P＞0.05）；贮藏5年的沙葱种子经VC+CeCl3处理后，MDA 含量显著高于CK（P＜0.05），其他浸种处理与CK 相比差异不显著（P＞0.05）；贮藏7年的沙葱种子经不同浸种处理后，MDA 含量与CK 相比均差异不显著（P＞0.05）。

图7 不同浸种处理对沙葱种子MDA 含量的影响

3 讨论与结论

种子在老化过程中，抗氧化酶活性逐渐降低[1]。有研究表明，MDA 能够抑制植物蛋白质合成并与蛋白质结合，引起蛋白质构象的变化，从而使酶钝化后酶活性降低、植物体内相关的生化反应速度或能力减弱，进而影响机体物质的合成与分解[19]，积累自由基，发生膜脂过氧化，降低种子活力[20]。本研究发现，CeCl3处理能够显著提高部分贮藏年限沙葱种子的抗氧化酶活性，这与适量Ce3+浓度能够提高菠菜中抗氧化酶POD、CAT、SOD 活性的研究结果一致[21-22]。VC 处理能够显著提高部分贮藏年限沙葱种子的抗氧化酶活性，这与VC 能显著增强小麦种子内SOD、POD、CAT 和APX 抗氧化酶活性的研究结果一致[23]。Ac-DEVD-CHO 处理能够提高贮藏5年、7年沙葱种子SOD 活性和贮藏3年、5年和7年沙葱种子的POD 活性；而VC 和Ac-DEVD-CHO 与CeCl3协同处理时，反而会降低不同贮藏年限沙葱种子的SOD活性，其中原因有待研究。

作为第二信使的活性氧（ROS），在低浓度时，能够介导植物激素直接或间接地在植物细胞信号级联转导途径中的多种应答反应[24]。种子老化过程中，线粒体中ROS 的爆发是诱发细胞程序性死亡（PCD）的调控器[25]。随着氧化损伤的积累，种子活力逐渐丧失，直至胚胎发生不可逆性死亡[26]。本研究发现，不同浸种处理对降低贮藏5年和7年沙葱种子·O2-产生速率均有促进作用，且VC 和Ac-DEVD-CHO 与CeCl3共同处理对清除贮藏3年、5年和7年沙葱种子·O2-产生速率的效果更好。VC 本身是一种能够在植物体内作为氧化胁迫防御的水溶性抗氧化剂，可直接清除·O2-、单线态氧和H2O2等活性氧的伤害，抑制膜质过氧化[27]。Ac-DEVD-CHO 主要抑制caspase-3 酶活性，有研究表明，·O2-位于caspase-3上游[26]，因此Ac-DEVD-CHO 处理对·O2-产生速率的影响不大。但当VC 与CeCl3共同处理时，·O2-产生速率显著下降，说明VC 和Ce3+能够加强清除·O2-产生速率的能力。Ac-DEVD-CHO 本身对·O2-产生速率影响不大，但与CeCl3共同处理时，能显著降低沙葱种子·O2-产生速率，因为Ce3+本身能够氧化·O2-并使其还原为H2O2[5]，从而导致·O2-产生速率降低。VC 和Ac-DEVD-CHO 处理能够显著降低贮藏5年和7年沙葱种子的H2O2含量，VC 和CeCl3共同处理能够提高贮藏3年和5年沙葱种子的H2O2含量，Ac-DEVD-CHO+CeCl3处理则对H2O2含量起抑制作用，但与单独使用Ac-DEVD-CHO 处理差异不大，说明主要是Ac-DEVD-CHO 抑制了H2O2含量的产生，而CeCl3处理对降低H2O2含量效果不明显。CeCl3处理会降低贮藏5年和7年沙葱种子的MDA 含量，VC 与CeCl3协同处理时，反而导致MDA含量升高，其中机制有待研究。

与CK 相比，CeCl3处理能够提高贮藏3年、5年和7年沙葱种子的SOD 活性；与其他浸种处理相比，CeCl3处理提高SOD 活性的效果最好。与CK 相比，不同浸种处理提高了贮藏3年沙葱种子的POD活性，提高了贮藏5年和7年沙葱种子的CAT 活性，显著提高了贮藏7年沙葱种子的APX 活性。与CK 相比，不同浸种处理均能降低贮藏5年和7年沙葱种子的·O2-产生速率；CeCl3处理提高了不同贮藏年限沙葱种子的H2O2含量，Ac-DEVD-CHO 处理降低了不同贮藏年限沙葱种子的H2O2含量，除CeCl3处理外的其他浸种处理与CK 相比均降低了贮藏7年沙葱种子的H2O2含量；CeCl3和VC 处理降低了贮藏5年和7年沙葱种子的MDA 含量。