玉米骨干自交系遗传多样性分析及茎腐病抗性鉴定

郭江岸，冯 勇，赵瑞霞，韩宇婷，苏二虎，梁红伟，赵逸雯，张来厚

玉米是典型的异花授粉作物，表现出极端的近交衰退和杂种优势[1]。玉米骨干自交系是育种家对株行、产量、抗性等性状严格考察筛选出的优秀亲本。我国玉米亲本自交系主要划分为唐四平头、旅大红骨、兰卡斯特、国外Reid、国内Reid 和P 群6 大遗传类群，对应的6 个标准自交系为黄早四、丹340、Mo17、B73、掖478 和齐319[2]。利用SSR 分子标记技术分析玉米种质遗传多样性是国内外学者利用较早，且简便、高效和准确的一种自交系分类鉴定技术，通过对样本DNA 多态性进行分析，可以得到样本DNA 序列以及在遗传性状上的调控和差异。迄今为止，国内外已见大量关于玉米自交系及杂交种遗传多样性分析的报道，为玉米自交系血缘鉴定提供了分子手段，节省了自交系鉴定时间，也为优良自交系的运用提供了理论基础[3-7]。近年来，我国处于传统农业与现代农业转折点，产量已经不再是制约玉米育种发展的主要因素，宜机收玉米新品种的选择和极端天气较多导致的玉米倒伏，对玉米新品种及自交系抗病性，尤其是茎腐病抗性提出了更高的要求[8]。

本试验运用SSR 分子标记技术对43 份玉米骨干自交系和11 份参照系进行遗传多样性分析，并运用田间接种方式对其茎腐病进行抗病性鉴定，以期为玉米骨干自交系高效利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用材料为内蒙古自治区农牧业科学院玉米研究所选育的43 份玉米骨干自交系和11 份参照系（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 遗传多样性分析

1.2.1.1 试验材料DNA 提取 2018年4月26日将54 份试验材料种于内蒙古自治区农牧业科学院院内试验地，种植密度为75 000 株/hm2，2 行区，9 m行长，2 次重复。待玉米生长至3～4 叶，逐区取幼嫩叶片，使用天根生化科技（北京）有限公司生产的植物基因组DNA 提取试剂盒进行DNA 提取，DNA 质量和浓度采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific）紫外分光光度计进行测定。

1.2.1.2 SSR 分子标记及引物选择 选用的40 对引物是由北京市农林科学院玉米研究中心报道的第Ⅰ组的20 对基本核心引物和第Ⅱ组的20 对扩展核心引物，这40 对引物为国家玉米品种区域试验DNA指纹鉴定指定引物，引物信息见参考文献［5］和［9］。

1.2.1.3 PCR 反应程序及电泳检测 PCR 反应体系为20 μL，包括DNA 2 μL，前后引物各0.5 μL，Mix 10 μL，剩余用DDH2O 补足。PCR 反应在BIO-RAD公司的PTC-100 型PCR 仪器上进行，程序为94 ℃5 min；94 ℃40 s，57 ℃35 s，72 ℃1 min，33 个循环；72 ℃10 min，4 ℃保存[5]。PCR 产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测[10-12]。

1.2.1.4 数据统计和分析 根据电泳结果，建立SSR扩增产物数据库。采用PowerMarker 3.25[13]、Ntsys 和MEGA 4.0 软件进行等位基因变异数目和多态性信息含量（PIC）等基本统计量的运算分析，并进行UPGMA 树的构建[14-16]。

1.2.2 茎腐病抗病性鉴定 2018年、2019年进行茎腐病抗性鉴定，采用禾谷镰孢菌进行接种（菌种由北京市农林科学院赵久然实验室提供）。接种方法为玉米播种时埋菌接种和成株期伤茎根埋法接种相结合。成株期伤茎根埋法鉴定接种前先进行田间浇灌，土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同。在玉米进入乳熟期调查发病情况[17-19]，病情等级划分见表2[20]。

2 结果与分析

2.1 自交系遗传分析

40 对SSR 引物在43 份玉米骨干自交系间共检测出等位基因变异242 个，每对引物检测的等位基因数为3～11 个，平均每对引物能够检测出6.05 个等位基因。PIC 值在0.30～0.86，平均为0.61，具有较好的多态性和品种分辨能力。

表1 43 份玉米骨干自交系和11 份参照系

表2 玉米茎腐病抗性鉴定的病情级别划分

2.2 聚类分析

结合PowerMarker 3.25 软件计算结果，利用UPGMA 方法对54 份自交系进行聚类分析。由图1可知，54 份材料可以划分为7 个类群，根据材料提供系谱信息，类群与聚类分析结果一致。

第一类为旅大红骨群体，包括参照系丹340（24）及骨干自交系M53-122（23）、M15N01（54）、M5168（22）、MZYF（5）；第二类为黄改群体，包括参照系黄早四（46）及骨干自交系M17Y336（18）、四287（52）、M09N007（38），参照系昌7-2（16）及骨干自交系MZ4（34）、M09N041（48）、M09N230（27）、MXZXJ853（28）；第三类群体为P 群，包括参照系齐319（49）、1145 （51） 及骨干自交系M17Y339（20）、M16NC（13）、M17Y73（2）；第四类群体为国外Reid群，包括参照系B73（44）、PH6WC（50）及骨干自交系M17Y11 （9）、M17Y338 （19）、M17Y332（15）、M18Y174（35）、M17N109（37）、M17N65（3）、M051（43）、M132Z（31）、M26Z（30）、M927（8）、M10ND101（25）、M17Y18（4）、Ms2-P6（33）、M17Y26（1）、M16Y041（40）、M17Y07（6）、M8349（12）、MZJ（10）；第五类群体为兰卡斯特群体，包括参照系Mo17（45） 及骨干自交系M5N32（47）、M17N358（36）、M17Y331（14）；第六类群体为国内Reid 群，包括参照系郑58（53）、掖478（32）及骨干自交系MK-461（42）、M3401（26）；另外，M17Y130（11）、MU6（41）、M18N41（7）、M17Y334（17）、M85Z（29）、MU7（39）、M17Y340（21）单独划分，与黄改、旅大红骨遗传距离较近，暂定为M 群。

图1 54 份自交系的SSR 标记聚类图

2.3 自交系茎腐病抗性鉴定

由表3 可知，43 份玉米骨干自交系茎腐病抗性差异明显，其中，高度抗病（HR）材料14 份、抗病（R）材料14 份、中度抗病（MR）材料9 份、感病（S）材料3 份、高度感病（HS）材料3 份。发病率低于30%的抗病材料37 份，占86.05%。抗病自交系主要来源于旅大红骨群、P 群和国外Reid 群，其他类群自交系对茎腐病抗性表现不同。

表3 43 份玉米骨干自交系田间茎腐病抗性鉴定

3 结论与讨论

选取的43 份玉米骨干自交系，加入了11 份参照系，选用了40 对农业行业标准推荐SSR 引物，具有多态性高、扩增效果好等特点。聚类分析结果显示，其中47 份玉米自交系被划入6 个类群，分别为旅大红骨群、黄改群、P 群、国外Reid 群、兰卡斯特群和国内Reid 群，另外M17Y130、MU6、M18N41、M17Y334、M85Z、MU7 和M17Y340 单独划为同一群体，暂定为M 群。根据自交系系谱来源，M 群部分材料来源于加拿大群体，部分材料来源于国外杂交种选系，若明确其血源归属，还需进一步加入其他类群（例如Iodent）种质对照。

43 份玉米骨干自交系中，包含5 个“内单”系列杂交种双亲，聚类分析结果显示，内单314 属于旅大红骨群×国内Reid 群，内早209 属于M 群×国外Reid 群，内单408、内单35（2018年审定）、内单407（2020年审定）均属于黄改群×其他群。黄改群×其他群杂优模式被重点应用，黄改群材料优点是丰产性高、综合抗性好，缺点是植株较繁茂、穗位高，脱水速率慢也较为突出，这与近年来玉米早熟、宜机收、耐密等需求相悖。因此，该杂种优势模式的继续应用更应该注意材料改良方向，取长补短或者注重杂交种区域化需求。

田间条件下，茎腐病发病程度除了受遗传因素影响，还受到环境条件因素影响。内蒙古地区环境较黄淮海、西南山区等地区干燥，湿度较低，腐霉菌接种效果不佳，本试验采用禾谷镰孢菌种并且连续两年在同一地块进行茎腐病病菌接种试验，接种前灌溉，播种前埋菌和多次伤茎根埋法相结合，最大限度地提高茎腐病发病水平，调查结果能够充分反映玉米自交系对茎腐病的抗性。试验结果显示，对茎腐病表现为抗病的自交系主要来源于旅大红骨群、国外Reid 群和P 群。P 群材料全部表现为高度抗病，这种现象应该和该群体材料生育期较长、生活力旺盛有关。黄改群、兰卡斯特群体、国内Reid 群体对茎腐病抗性表现不同。M 群中M17Y130、MU7 和MU6 对茎腐病抗性表现为感病和高度感病，系谱显示其全部来源于加拿大群体选系，M17Y340、M18N41 和M85Z 茎腐病抗性表现抗病和高度抗病，系谱显示全部来源于国外杂交种选系。因此，黄改群、兰卡斯特群、国内Reid 群和M 群材料的利用应结合其抗病性特点。