复方丹参滴丸对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子β1/Smads信号通路表达的影响

罗琼，李琴，石秀祯，郭爱莉，李静

作者单位：1长江航运总医院内分泌科，湖北 武汉430010；2华中科技大学同济医学院附属协和医院中医科，湖北 武汉430022

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是最常见的代谢性疾病，近年来，随着人们生活方式的改变和人口老龄化等因素的影响，糖尿病的发病率正在逐渐增加，已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三大危害人类健康的重大疾病［1-2］。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见微血管并发症，也是导致终末期肾病的主要原因之一［3］。DN 的主要病理改变表现为肾脏纤维化［4］，而转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作为促进肾脏纤维化的细胞因子之一，在慢性肾病中起着至关重要的作用，作为主要的治疗靶点正在逐渐被临床所认可［5-6］。已有研究发现：TGF-β1 可通过激活Smads 信号转导促进肾上皮向间质转换，从而导致肾纤维化，最终进展为肾功能不全［7］。大量研究发现，TGF-β1/Smads 信号通路与糖尿病肾病发生、发展及肾脏纤维化密切相关［8-9］。

目前临床上公认的糖尿病肾病的治疗方案常常在严格控制控制饮食、血糖、血脂、血压的基础上，应用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（Angiotensin Ⅱreceptor antagonist，AngⅡ）、血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）等药物加以防治，但这些措施很难完全有效延缓糖尿病肾病向终末期肾病发展［10］。中医药在糖尿病的防治上取得了显著的成效，复方丹参滴丸（compound Danshen dripping pills，DSP）是一种新型中药制剂，是目前临床上用于缓解和治疗糖尿病肾脏病变、冠心病等的常见药物之一。已有研究发现［11-14］，复方丹参滴丸对糖尿病患者早期肾病损害具有明显的保护作用，但其作用机制并不完全清楚。因此，本研究通过观察DSP 对DM 大鼠肾脏TGF-β1/Smads 信号通路的影响，从而探讨DSP 对糖尿病肾脏保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取50 只6～8 周龄的健康清洁级、雄性Wistar 大鼠，体质量（200±20）g，购于昆明医科大学动物实验中心，室温（24±2）℃，湿度（45±5）%，自然光照，室内保持安静。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。

1.1.2 主要试剂 复方丹参滴丸（天士力制药集团股份有限公司）；链脲佐菌素（美国Sigma 公司）；TGF-β1 兔抗大鼠一抗、重组人β 肌动蛋白（β-actin）兔抗大鼠一抗、羊抗兔IgG（北京博奥森生物技术有限公司）；p-Smad2、p-Smad3 的酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（Cell Signaling 公司）；Smad7、肾损伤分子-1（KIM-1）、骨桥蛋白（OPN）的ELISA 试剂盒（武汉华美公司）；RIPA 裂解液（凯基生物）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（凯基生物）；PCR 引物（博士德生物）；逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒（Taka-Ra）。

1.1.3 主要仪器 全自动生化分析仪（北京普朗新技术有限公司）；血糖仪及配套试纸（三诺生物传感股份有限公司）；ABI 7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；酶标仪（美国Molecular Devices 公司）、电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；数码凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模 大鼠适应性饲养7 d 后，按随机数字表法将50 只大鼠随机分为空白对照组（NC组，n=10）、造模组（n=40）。然后造模组大鼠使用腹腔注射1%链脲佐菌素（60 mg/kg）进行造模，对照组大鼠腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液（0.1 mol/L），在72 h 后尾静脉采血，从而测定血糖浓度≥16.7 mmol/L时为造模成功［15］。

1.2.2 造模后处置 其中大鼠成模37 只，死亡3只，成模率为92.50%。最后从中选取造模成功的30只老鼠采用随机数字表法分为糖尿病模型组（DM组，n=10）、复方丹参滴丸低剂量组（DSP 低剂量组，n=10）、复方丹参滴丸高剂量组（DSP 高剂量组，n=10）。DSP 低、高剂量组大鼠每天分别给予200、400 mg/kg 的DSP 与生理盐水混悬液灌胃治疗，NC 组及DM 组大鼠给予等量的生理盐水灌胃，均每日1 次，持续8周。

1.2.3 血糖、血肌酐、尿素氮检测 实验结束，血糖仪检测各组大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）水平。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后静脉取血，分离血清，使用全自动生化分析仪进行各组大鼠的血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的检测。

1.2.4 荧光定量PCR 法检测各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表达水平 取各组肾脏组织50 mg，先提取总RNA，然后进行反转录，最后对反转录产物进行扩增。其中反应体 系 是20 μL，反 应 条 件 是stage1：95 ℃，30 s。stage2：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40 个循环。PCR 扩增的特异性引物序列见表1。

表1 PCR扩增的特异性引物序列

1.2.5 蛋白质印迹法（Western Blot）检测各组大鼠肾脏组织TGF-β1 的蛋白表达 取各组肾脏组织80 mg，提取总蛋白，测定其浓度，上样等质量的蛋白。然后电泳、进行转膜、封闭、孵育TGF-β1 一抗（1∶1 000）4 ℃过夜，用TBST 清洗，37 ℃孵育二抗（1∶10 000）1 h，再次用TBST 清洗，最后用ELC 发光试剂盒显影。蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.2.6 ELISA 法检测各组大鼠尿中KIM-1、尿中OPN 以及肾脏组织p-Smad2、p-Smad3、Smad7的浓度表达水平 代谢笼收集各组大鼠尿液，然后采用ELISA 试剂盒检测各组大鼠尿中KIM-1、OPN 的浓度。取部分新鲜的肾脏组织，使用ELISA 试剂盒检测各组大鼠肾脏组织中p-Smad2、p-Smad3、Smad7的浓度表达水平。

1.3 统计学方法应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。观测资料均为计量数据，采用x ± s 表示，组间比较采用单因素方差分析，组间方差齐用LSD法，方差不齐用Tamhane’s T2（M）检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖比较与NC组相比，DM组大鼠血糖明显升高（P ＜0.05）；与DM 组相比，DSP 低、高剂量组大鼠血糖明显降低（P ＜0.05），且高剂量组较低剂量组有进一步下降的趋势。见表2。

2.2 各组大鼠肾损伤标志物水平的比较与NC 组相比，DM组大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN浓度明显升高（P ＜0.05），提示糖尿病引起了大鼠肾脏损伤；与DM组比较，DSP低、高剂量组大鼠血Scr、血BUN、尿KIM-1、尿OPN 浓度明显降低（P ＜0.05），且高剂量组尿KIM-1、尿OPN 浓度明显低于低剂量组（P ＜0.05），说明DSP剂量依赖性地改善了糖尿病大鼠的肾脏损伤，对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。见表2。

2.3 各组大鼠肾脏组织TGF-β1 的mRNA 和蛋白表达与NC组相比，DM组大鼠肾脏组织TGF-β1的mRNA与蛋白表达均明显升高（P ＜0.05）；与DM组相比，DSP低、高剂量组大鼠肾脏组织TGF-β1的mRNA与蛋白均明显减低（P ＜0.05），且高剂量组明显低于低剂量组（P ＜0.05），说明DSP剂量依赖性地抑制了糖尿病大鼠的肾脏TGF-β1表达。见表3，图1。

2.4 各组大鼠肾脏组织Smads 的mRNA 和蛋白表达

2.4.1 各组大鼠肾脏组织Smad2、Smad3、Smad7 的mRNA 表达 与NC 组比较，DM 组大鼠肾脏组织Smad2、Smad3 的mRNA 表达水平明显升高（P ＜0.05），而Smad7 的mRNA 表达水平明显降低（P ＜0.05）；与DM 组比较，DSP 低、高剂量组大鼠肾脏组织Smad2、Smad3 的mRNA 表达水平均明显减低（P ＜0.05），而Smad7 的mRNA 表达水平明显升高（P ＜0.05）；且DSP 高剂量组Smad2、Smad3的mRNA表达水平低于DSP 低剂量组（P ＜0.05），Smad7 的mRNA 表达水平高于DSP 低剂量组（P ＜0.05）。见表4。

表2 各组大鼠血糖及肾损伤标志物水平的比较/x ± s

表3 各组大鼠肾脏组织TGF-β1的mRNA和蛋白表达/x ± s

图1 各组大鼠肾脏组织的蛋白表达（n=10）

表4 各组大鼠肾脏组织Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达/x ± s

2.4.2 各组大鼠肾脏组织p-Smad2、p-Smad3、Smad7 的蛋白表达 与NC 组比较，DM 组大鼠肾脏组织p-Smad2、p-Smad3 的蛋白水平明显升高（P ＜0.05），而Smad7 的蛋白水平明显降低（P ＜0.05）；与DM 组比较，DSP 低、高剂量组大鼠肾脏组织p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表达水平均明显减低（P ＜0.05），而Smad7 的蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）；且DSP 高剂量组p-Smad2、p-Smad3 的蛋白表达水平低于DSP 低剂量组（P ＜0.05），Smad7 的蛋白表达水平高于DSP低剂量组（P ＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠肾脏组织p-Smad2、p-Smad3、Smad7的蛋白表达/x ± s

3 讨论

糖尿病在中医学中被称为“消渴”，而“糖尿病肾病”是消渴病并发症，发于肾脏，因此吕仁和教授称其为消渴病肾病［16］。消渴病肾病的基本病机为“肾虚血瘀”，而活血益气法是治疗此病的主要措施，并特别强调活血法贯穿整个治疗过程［17-19］。DSP 是一种新型中药制剂，以丹参、冰片、三七等中药为主要成分，具有活血化瘀、行气止痛等功效，且具有起效迅速、生物利用度高的特点［20］。其中丹参味苦、性微寒，是主要的活血化瘀中药，古代医书上有“一味丹参，功同四物（当归、川芍、白芍、熟地）”之说。冰片辛香而寒凉，善于开窍醒神、清热止痛。三七味苦而甘、性温，具有良好的活血化瘀、止血止痛的功效。现代研究发现：DSP 可改善DM 动物模型的胰岛功能、降低血糖水平、缓解炎症反应［21］、改善DM所引起的心脏［22］、肾脏［23］等脏器的损伤，在DM 及其多种并发症的防治上显示了较好的疗效［24-26］。

DN 是糖尿病的主要微血管并发症，也是导致终末期肾病的主要原因之一［27］。当血清Scr、BUN及尿KIM-1、OPN 等指标出现异常的时候，可以提示糖尿病可能出现了肾病的并发症［28-29］。在评价肾功能损伤时，尿KIM-1、尿OPN 比血肌酐、尿素氮等指标更为敏感，因为血肌酐、尿素氮常常在肾功能严重下降时才会发生明显的变化，而尿KIM-1、尿OPN水平常常在肾脏存在轻微病变时就会发生比较明显的变化，所以可以被用来评价肾脏的早期损伤［30-31］。本研究发现：与NC 组比较，DM 组大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮浓度明显升高，提示糖尿病大鼠模型出现肾脏的损伤；与DM 组比较，DSP 低、高剂量组大鼠尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮浓度明显降低，且高剂量组大鼠尿KIM-1、OPN 浓度明显低于低剂量组，提示DSP 剂量依赖性地改善了糖尿病大鼠的肾脏损伤，对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。

TGF-β1是TGF-β家族中的一个核心成员，具有广泛的生物学效应。已有研究发现：若肾脏中TGFβ1 的表达水平过高，则可以促进成纤维细胞生长、增加细胞外基质含量，从而引起肾脏硬化［32］。TGFβ1/Smads 信号通路作为TGF-β1 介导的重要信号通路，在肾脏纤维化中发挥着不可替代的作用［33-34］。其中，TGF-β1 可与TGF-β1Ⅱ型受体结合，从而激活TGF-β1Ⅰ型受体并将Smad2、Smad3蛋白磷酸化，而磷酸化的Smad2/Smad3 与Smad4 形成活性的转录复合物进入细胞核启动靶基因的转录，最终影响一些参与肾脏损伤分子的表达［35-36］。Smad7是TGF-β1信号通路的负反馈调节因子，主要通过与TGF-β1Ⅰ型受体结合抑制TGF-β1 信号转导［37］。大量研究发现：糖尿病模型大鼠体内TGF-β1 水平呈高表达，而Smads 信号表达异常的状态［38］。本研究结果显示：与NC 组相比，DM 组大鼠肾脏TGF-β1 的mRNA 和蛋白表达明显升高；Smad2、Smad3 的mRNA 表达水平明显升高，而Smad7的mRNA表达水平明显降低；p-Smad2、p-Smad3 的浓度明显升高，而Smad7 的浓度明显降低。与DM 组相比，DSP 低、高剂量组大鼠肾脏TGF-β1 的mRNA 和蛋白表达明显降低；Smad2、Smad3 的mRNA 表 达 水 平 明 显 降 低，p-Smad2、p-Smad3 的浓度明显降低，且高剂量组明显低于低剂量组；而Smad7 的mRNA 表达水平明显升高，Smad7的浓度明显升高，且高剂组明显高于低剂量组。提示：DSP 剂量依赖性的抑制了糖尿病大鼠肾脏TGF-β1/Smads信号通路的表达。

综上所述，DSP 可能通过抑制TGF-β1/Smads 信号通路，从而延缓STZ诱发的DM大鼠肾损害。