中医药调控自噬减轻心肌缺血再灌注损伤研究进展

崔健昆，李佳佳，徐 泽,韩玉生

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/RI)是指缺血心肌在恢复血液供应后，病情反而恶化，出现较灌注前更严重的损伤。心脏移植、溶栓疗法、心肺复苏术等都可能发生MI/RI。MI/RI主要有以下4种表现形式：①再灌注性心律失常;②心肌顿抑;③微血管阻塞;④致死性心肌再灌注损伤[1]。造成损伤的原因主要涉及钙超载、炎症反应、氧自由基生成增多、细胞凋亡、自噬等。本文主要就自噬在MI/RI中发挥的作用机制，以及中医药疗法对自噬影响的研究进展进行综述。

1 自噬的分类

自噬是指自身长寿命或过度表达的细胞质蛋白以及受损的细胞器被溶酶体降解,降解后的产物被再次利用,进一步生成维持生命活动的能量物质。自噬被过度活化会引起细胞的自我消化，甚至导致死亡[2]。自噬被认为是细胞的Ⅱ型程序性死亡[3]，主要分为以下3种形式:介导自噬，是指使未折叠的可溶性蛋白质直接跨溶酶体膜易位,用于清除可溶性蛋白质分子；微自噬，是指溶酶体膜直接内陷底物，将其包裹后再降解；巨自噬，是指将底物包裹后，先形成自噬小泡,然后与溶酶体膜融合，再把被包裹物质降解[4]。3种形式中巨自噬是最常见的一种形式。

2 自噬与心肌缺血再灌注损伤

在MI/RI过程中，由于外界环境的改变，自噬被激活，且在不同时期调控自噬的信号通路亦不相同。目前研究表明，在心肌缺血期，由于ATP生成减少，AMPK被激活，致mTOR失活,从而催化ULK1诱导自噬。也有研究证实AMPK可以直接激活ULK1[5]。ULK1被激活后，形成ULK1复合体,触发Ⅲ级PI3K复合体，二者之间相互作用形成吞噬泡,扩展后形成自噬小体。自噬体与溶酶体的融合是通过SNAREs、GTPase Rab7和与溶酶体相关的膜蛋白介导的。底物被降解后，可以释放到细胞质中循环[6]。在再灌注期，因为心肌细胞不再缺血缺氧，所以AMPK途径被抑制，取而代之的是Beclin-1再灌注阶段，具体机制可能与Bcl-2蛋白相关。

3 中医药调控自噬改善MI/RI

随着中医药研究的深入,中药、针刺、艾灸、穴位埋线等被证实可以通过调控自噬在减轻心肌缺血再灌注损伤中发挥积极作用。

3.1通过促进自噬减轻MI/RI

3.1.1中药提取物 荭草苷来源于中药红蓼,Liu等[7]发现荭草苷可明显降低血清LDH和CK-MB水平，增加自噬体数量，上调蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表达水平。而在使用自噬抑制剂干预后,荭草苷的上述作用减弱。综合实验结果得出，荭草苷能够通过促进自噬起到保护心肌细胞的作用。卢长青等[8]通过冠状动脉结扎法复制小鼠MI/RI模型，发现五味子乙素能显著降低MI/RI模型小鼠血清心肌酶含量，减小心肌梗死面积，诱导Beclin-1、p-AMPK和p-ULK1的表达，并抑制p-mTOR。在AMPK基因敲除小鼠的心肌组织中，Beclin-1的表达水平明显减少。提示AMPK/mTOR/ULK1通路参与了MI/RI损伤自噬的调控，五味子乙素可以通过诱导自噬减轻损伤。三七皂苷是从中药三七中提取出的活性成分，有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血等药理作用。有学者通过对比三七总皂苷组、假手术组、I/R组的心肌酶、MDA、活性氧变化，和LC3、Beclin-1、Atg5、BNIP3、HIF-1a等指标的表达水平发现，与I/R组比较，中药组血清CK、MDA、活性氧浓度降低，HIF-1a、BNIP3、Atg5和Beclin-1的表达显著增加。HIF-1a/BNIP3/Beclin1/Atg5信号通路是缺血再灌注过程中调节线粒体自噬的主要通路，说明三七皂苷对抗MI/RI的机制可能与HIF-1a/BNIP3自噬途径有关[9]。Tan等[10]探讨了和厚朴酚对小鼠心肌I/R损伤的保护作用，得出和厚朴酚可以显著降低小鼠心肌细胞活性氧的产生和线粒体损伤。实验结果还显示，I/R组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和蛋白p62水平均较对照组升高。和厚朴酚组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值进一步升高，而蛋白p62水平明显下调，在应用自噬流抑制剂氯喹后，和厚朴酚的这些作用被部分消除。说明和厚朴酚通过增强自噬过程，对抗MI/RI，从而对心肌起到保护作用。刺芒柄花素是从中药黄芪中提取出的化合物，具有抗炎、神经保护等作用。在MI/RI过程中，刺芒柄花素可以使蛋白p62表达降低，Beclin-1表达上升，从而减轻细胞损伤。另外实验证实了I/R能通过降低溶酶体酸化水平来抑制衰老组织或细胞的溶酶体降解过程，而刺芒柄花素能逆转这一过程[11]。黄芪中的另一种提取物-黄芪甲苷也可以通过调控自噬，减轻缺血再灌注造成的心肌损伤。有实验证明，低剂量组的黄芪甲苷减轻心肌损伤主要与降低炎症因子水平有关；而中、高剂量组的黄芪甲苷主要通过提高Akt、Bcl-2以及mTOR等自噬相关蛋白的表达水平来保护心肌细胞，当敲掉小鼠Akt、mTOR及Bcl-2等蛋白后，损伤程度显著提高，激活或补充上述蛋白后损伤明显缓解[12]。

3.1.2穴位埋线 王一茗等[13]实验发现，电镜下埋线预处理组自噬泡的数量较缺血再灌注组增多，血清心肌酶水平明显降低，p62表达水平也显著下降。p62参与细胞自噬全过程，可以被自噬溶酶体降解。穴位埋线还能使蛋白ATG9A表达上升，ATG9A是一种自噬泡膜蛋白，参与自噬过程中囊泡蛋白的募集。综上所述，穴位埋线可以减轻心肌I/R损伤，其机制可能与促进自噬有关。

3.2通过抑制自噬减轻MI/RI

3.2.1中药提取物 沈秀珍等[14]给予大鼠银杏总黄酮灌胃处理7 d后建立MI/RI模型,检测心肌酶、MDA和SOD水平及自噬相关蛋白表达水平。结果显示，与I/R组比较,银杏总黄酮干预组心肌损伤标志物表达减少,Beclin-1表达水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低,说明银杏总黄酮保护心肌的作用与抑制细胞过度自噬有关。Fan等[15]在研究丹参素在自噬与凋亡中的作用时发现，在I/R期间，自噬相关蛋白显著上调。经丹参素预处理后自噬相关蛋白表达降低，自噬体形成减少,mTOR信号上调。mTOR的激活可以降低缺血后自噬的活性，同时减少细胞凋亡，提示丹参素负调控自噬。丹参中的另一种成分——丹参酮ⅡA，也可以减少心肌I/R损伤。丹参酮ⅡA可以使心肌酶释放减少，使COX水平以及SOD的活性升高，以及使PI3K、p-Akt/Akt、mTOR的表达水平上调。在使用PI3K/Akt通路抑制剂后，丹参酮ⅡA对MI/RI的上述影响降低，说明其影响是通过作用于PI3K/Akt通路，从而激活mTOR实现的[16]。洪叶等[17]将香青兰总黄酮用于大鼠MI/RI模型灌胃处理后发现，自噬抑制剂与香青兰黄酮都能对再灌注期的心肌细胞起到减轻损伤的作用。自噬抑制剂在再灌注期能使心肌梗死面积减小，细胞凋亡减少，以及使心肌酶水平、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达降低。香青兰总黄酮的作用效果与自噬抑制剂相似，证明香青兰总黄酮也能通过抑制细胞的过度自噬，减轻心肌损伤。表没食子儿茶素没食子酸酯是从绿茶中提取的，有抗氧化、抗炎、逆转肿瘤多药耐药性的作用。李春凤等[18]证实在心肌缺血期即可激活自噬，在再灌注期自噬的程度加强。且3-MA对缺血期无显著影响；而在再灌注期，3-MA可以通过抑制自噬程度减少心肌酶的释放。与模型组及3-MA组相比，中药组的自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平下调，心肌酶的释放减少，mTOR表达水平上调，所以其保护心肌的作用可能与缺血期mTOR负反馈诱发自噬，再灌注期抑制过度自噬有关。Huang等[19]指出了黄连素预处理可显著改善小鼠心脏功能，降低自噬相关蛋白LC3-II、SIRT1、BNIP3、Beclin-1的表达水平。还可以使自噬体形成减少，使心肌细胞中p-AMPK和p-mTORC2的水平降低，从而在I/R损伤过程中起到保护心肌细胞的作用。葛根素也能减轻心肌I/R损伤，其机制可能与抑制线粒体mPTP的开放有关。在MI/RI过程中，葛根素还可以使蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ以及细胞色素C表达水平下调，从而减轻细胞过度自噬，减少凋亡[20]。王鹏等[21]通过体外模拟心肌I/R模型，观察大鼠再灌注后LC3-Ⅱ、Beclin-1等自噬相关蛋白表达水平和线粒体mPTP开放情况。结果显示，黄芩苷可以使心肌梗死面积减小，蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达量明显下降，NAD+含量明显增加。从而得出，黄芩苷能通过抑制线粒体mPTP的开放达到抑制自噬过度激活的作用。唐虹等[22]认为牡荆素可以抑制I/R后的过度自噬。通过用牡荆素干预心肌I/R大鼠可显著改善大鼠心脏收缩张力、冠脉流量等，改善I/R后的心功能。牡荆素还能减轻心肌梗死面积，降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值，下调Beclin-1蛋白的表达水平，上调P62表达水平。陈小兰等[23]研究发现，南葶苈子提取液预处理可以改善心肌组织水肿、炎症等现象，降低血清中心肌酶含量，以及下调蛋白Beclin-1、p38表达水平，降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，上调p-ERK1/2蛋白的表达。说明南葶苈子提取液可以通过抑制自噬，保护心肌细胞，其机制可能与p38、ERK1/2信号通路有关。刁思帏等[24]研究了三氟淫羊藿素对大鼠MI/RI的作用及其与Akt/mTOR自噬信号通路之间的关系。实验结果显示，与模型组比较，三氟淫羊藿素组可以降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白表达水平，使蛋白Akt和mTOR的磷酸化水平明显升高，减轻心肌损伤。因此指出了三氟淫羊藿素能保护心肌细胞，抑制自噬的过度激活，机制可能与Akt/mTOR信号通路有关。

3.2.2中药汤剂 唐丹丽等[25]探讨了栝楼薤白半夏汤对大鼠心肌I/R损伤的影响，结果表明，缺血再灌注后大鼠血清心肌酶的含量与自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ水平以及凋亡蛋白Bax表达水平均上调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也升高。经栝楼薤白半夏汤及自噬抑制剂干预后上述指标水平均降低，且栝楼薤白半夏汤组的作用较自噬抑制剂组更加明显。从而得出心肌缺血再灌注可以激活自噬，加重凋亡，而栝楼薤白半夏汤能对抗上述作用，减轻心肌损伤。彭霞等[26]用加味丹参饮给大鼠灌胃处理7 d后建造MI/RI模型。检测心肌中蛋白Beclin-1的表达量和心肌Atg5 mRNA的水平。实验结果表明，中药处理组较缺血再灌注损伤组的Beclin-1表达量降低，Atg5 mRNA的水平明显下降，心肌梗死面积率也显著降低。在透射电镜下可以看到缺血再灌注组形成了典型的自噬体和自噬溶酶体，自噬现象明显。而加味丹参饮处理组仅见少量的自噬泡，心肌细胞结构亦较缺血再灌注组明显改善，说明加味丹参饮能够通过调控自噬，发挥对抗MI/RI的作用。

3.2.3中成药 贾合磊等[27]研究发现参附注射液能够显著降低大鼠血清中心肌酶水平以及蛋白Beclin-1表达水平，下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，并提高p62的表达水平，以上效果呈浓度依赖性变化。还发现参附注射液能显著提高心肌组织PI3K/Akt/mTOR通路的活性，抑制自噬的过度激活。综上得出，参附注射液在MI/RI中保护心肌的作用与调控自噬密切相关。解欣然等[28]通过模拟MI/RI模型，探讨参元丹对心肌细胞自噬的影响，并测定蛋白LC3和Beclin1的表达水平。结果表明，相应浓度的实验组较空白血清组上述蛋白的表达水平下调。浓度为5%时，测定蛋白Beclin-1表达量，参元丹组是空白血清组的0.58倍；浓度为10%时，参元丹组的上述蛋白表达量是空白血清组的0.50倍。从而得出，参元丹能抑制自噬过度激活，减轻心肌I/R损伤。杨海龙等[29]通过制备小鼠心肌缺血再灌注模型，研究丹蒌片对心肌I/R损伤的保护作用和具体作用机制。检测蛋白LC3B、BNIP3的表达水平，评价心肌调亡水平。实验结果显示，丹蒌片组和3MA组较模型组的左室射血分数升高，蛋白LC3B和BNIP3的表达水平下降，心肌梗死面积比和心肌凋亡率均明显降低。因此得出，丹蒌片能通过调节心肌自噬和减少凋亡来减轻心肌损伤，改善心功能，从而保护心肌细胞。

3.2.4针刺与艾灸 电针预处理是指在针刺预处理的基础上联合电针疗法，进一步提高治疗效果。谭成富等[30]实验证明，电针和艾灸都可以减轻缺血再灌注引起的心肌损伤,降低凋亡指数、下调蛋白Beclin-1以及LC3Ⅱ表达水平,且电针效果更加明显。由此证实了在MI/RI过程中，电针与艾灸预处理都可以通过调节自噬发挥保护心肌的作用。还有学者探讨了在再灌注后的不同时间采用电针干预内关穴，对MI/RI的保护作用。在再灌注后即刻电针和再灌注后30 min时、再灌注60 min时、120 min时开始电针相比较，再灌注30 min时采用电针干预效果最好，LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Bax表达水平均明显降低，心肌梗死面积也显著减小。提示电针处理可以抑制细胞的凋亡和自噬，进一步证明了电针在再灌注期不同时间干预与其保护MI/RI的效应存在关联[31]。Zhang等[32]在实验中使用3-MA作为阳性对照药物，比较艾灸对心脏的保护作用。结果表明，MI/RI后Akt以及蛋白Beclin-1的表达上调，蛋白Bcl-2表达下调，而艾灸和3-MA预处理可以逆转MI/RI诱导的上述变化，并可明显减少坏死面积，减少心肌酶的释放。说明艾灸预处理对MI/RI的保护作用与自噬抑制剂相似，可能是通过调节蛋白Beclin-1、Bcl-2和Akt的方式来抑制自噬，减轻损伤。

4 自噬与凋亡

细胞自噬和凋亡的发生不是相互独立的事件，二者存在密切的内在联系，且相互影响。自噬可以启动凋亡；也可以抑制凋亡；还可以向凋亡转化。心肌缺血再灌注过程中，自噬水平过度可能会导致细胞的自噬性细胞死亡，在此过程中也存在着细胞凋亡的现象。自噬的关键调节因子与Bcl-2家族成员存在重叠，Bcl-2家族成员主要与调节细胞凋亡有关。一般将其分为两种蛋白，分别发挥抑制细胞凋亡的作用以及促进细胞凋亡的作用，前者如BCL-2蛋白；后者又可分为含有4个BH结构域的蛋白，如BAX蛋白，和只含BH3结构域的蛋白，如PUMA蛋白[33]。Bcl-2蛋白还可以通过结合Beclin-1发挥抑制自噬的作用，若破坏Beclin-1/Bcl-2复合物则可以恢复自噬的诱导[34]。在缺血再灌注的早期可以通过自噬将长寿命蛋白及受损细胞器分解后供细胞再次利用，促进细胞生存；而在再灌注期，蛋白Bcl-2与Beclin-1剥离，导致自噬过度表达，并促进细胞凋亡，引起细胞死亡。其原因可能与灌注时BNIP3的增加、Bc1-2的下降，加剧激活Beclin-1诱导自噬相关。BNIP3具有破坏线粒体完整性、增加超氧化物和促凋亡因子的作用[35]。有研究证明Bc1-2家族调节自噬的功能与凋亡通路相关蛋白BAX和BAK有关，在敲除掉BAX和BAK后，Bc1-2家族蛋白对自噬的作用不复存在，说明此作用的发挥与细胞内凋亡通路的完整性相关[36]。自噬和凋亡之间还存在许多相互作用的分子，如p62蛋白，也是自噬和凋亡之间彼此作用的重要蛋白之一。p62可以发挥有效激活caspase-8的作用，一旦死亡受体被激活后，caspase-8会将p62清除[37]。Atg3、Atg5、Beclin-1和RIPK1等也可以被caspase-8裂解[38]。此外，Zhu等[39]报道了caspase-3参与Beclin-1的裂解，使Beclin-1失活，诱导凋亡。这些发现强调了自噬和凋亡之间可以通过共同的分子调控因子的相互作用。因此，自噬、凋亡之间相互制约，具体机制目前尚不明了，了解自噬和凋亡之间相互作用的具体机制可能会成为日后治疗MI/RI的重要突破。

5 小 结

自噬在心肌缺血再灌注过程中发挥重要作用，其影响具有双向性。正常情况下，自噬对维持心脏正常功能有重要作用。但在心脏病理情况中，自噬过度或不足都有可能损伤心肌。有学者认为，自噬的过程就是调节阴阳平衡的过程[40]。自噬不足会导致代谢产物的堆积，自噬过度会导致自噬性凋亡，只有自噬适度时才会对细胞起到保护作用，这与中医理论中的阴阳自和不谋而合。近年来研究发现，有的中药通过抑制自噬改善心肌缺血再灌注损伤，也有的中药通过促进自噬保护心肌细胞，这种差异是否与造模时间、造模方式、损伤程度差异或动物年龄差异有关目前尚不明了，但中药能通过自噬减轻心肌I/R损伤毋庸置疑。这为后续的研究指出了方向，利用中医药调控适度的自噬治疗心肌缺血再灌注损伤，充分发挥中医药疗法多靶点、多调控及不良反应小的特性，并进一步探讨自噬参与MI/RI的调节机制，选择性抑制或者激活自噬减轻心肌损伤，将会成为一种新的治疗措施。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。