超高效液相色谱-串联质谱法测定沼液中的林可霉素和大环内酯类抗生素

仲伶俐， 郑幸果， 赵 珊， 雷欣宇， 黄世群， 秦 琳， 郭灵安， 李 曦

(四川省农业科学院分析测试中心，四川成都 610066)

沼液是人、畜禽粪污以及秸秆等有机物在沼气池中，经过充分无氧发酵产生沼气后的残留液体，含有植物生长所需的多种水溶性养分，氮、磷、钾等常量元素和多种微量元素，以及腐殖质、水解酶和氨基酸等多种活性物质[1]。作为优质的有机肥料，沼液的施用也符合我国农业部提出的“双减行动”及“一控两减三基本”的政策要求[2]。但随着抗生素在畜牧养殖业中的广泛使用，动物体内不能完全代谢降解的兽药抗生素随畜禽粪便和尿液排出，进而通过有机肥料的施用进入农田土壤,将导致环境抗生素残留以及耐药细菌的传播扩散，对生态环境和人体健康存在潜在危害性[3,4]。抗生素污染已经引起国内外环境领域学者的重视，我国部分地区已开展了对施肥土壤的抗生素污染调查[5]，也有研究者在水、土壤、污泥等多种环境中检出了抗生素类药物残留[6]。

大环内酯类药物(Macrolide Drugs，MALs)是一类广谱抗生素兽药，在畜禽养殖中被广泛用于防治呼吸道、胃肠道感染等疾病，同时也可作生长促进剂[7-9]。国内外关于大环内酯类抗生素的研究所涉及的基质较为广泛，有动物肌肉[7,8]、奶[9]、蜂蜜[10]、土壤[4,11]、粪便[3,4,11,12]、污泥[6]、水产养殖环境沉积物[13]、水[4,14,15]等。所用检测仪器普遍为液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，前处理技术多采用固相萃取法[3,4,6-8,14-16]、基质固相分散法[9]、QuEChERS法[13]。目前国内对沼液中抗生素药物的研究甚少，抗生素种类也主要涉及喹诺酮类、四环素类、磺胺类和β-受体激动剂类。王光杰等建立了猪粪便、尿液和沼液中磺胺类、喹诺酮类和红霉素的LC-MS/MS检测方法[16]；贺南南等分析了南京市以猪、牛、鸡粪发酵的沼液样品，用高效液相色谱-荧光检测法检测出4种喹诺酮类药物[17]，并用高效液相色谱-紫外检测法测定了沼液中3种四环素类和6种磺胺类抗生素，最终检测出磺胺嘧啶和磺胺甲恶唑[18]；杨挺等建立了沼液中9种β-受体激动剂的检测方法并对样品进行了测定[19]。因此，有必要建立沼液中大环内酯类抗生素的快速分析方法，以了解沼液中大环内酯类抗生素的残留水平和污染状况，为进一步监测其在环境中的传播情况提供技术基础。

本研究建立了反相固相萃取净化结合LC-MS/MS测定沼液中林可霉素和6种大环内酯类抗生素的方法，该方法省去了固相萃取净化后的常规浓缩操作步骤，在准确的同时，操作更加简单、快速，同时节约成本。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC/MS-8040超高效液相色谱-串联质谱仪(日本，岛津公司)；N-EVAP-112氮吹浓缩仪(美国，Organomation Associates,Inc.公司)；TG -16台式高速离心机；WH-3微型涡旋混合仪；DT-1002A电子天平。Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3mL，美国Waters公司)；Bond Elut C18 固相萃取小柱(100 mg/1mL ，美国Agilent公司)。

7种抗生素标准品：林可霉素(Lincomycin，纯度99.6%)、螺旋霉素(Spiramycin，纯度95.0%)、替米考星(Tilmicosin，纯度80.7%)、泰乐菌素(Tylosin，纯度94.1%)、红霉素(Erythromycin，纯度95.0%)、罗红霉素(Roxithromycin，纯度96.2%)，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；交沙霉素(Josamycin，纯度91.2%)购自曼哈格生物科技有限公司。甲酸(色谱纯，上海安谱)，甲酸铵(色谱-质谱级，上海安谱)；甲醇(色谱纯，美国fisher公司)、乙腈(色谱纯，美国fisher公司)。实验用水均为优普超纯水系统制备。

1.2 溶液配制

分别准确称取适量林可霉素、替米考星、泰乐菌素、红霉素、螺旋霉素、交沙霉素和罗红霉素标准品于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为200 μg/mL的单标标准储备溶液，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中。分别准确吸取各单标标准储备溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制成质量浓度为10.0 μg/mL的混合标准储备溶液。吸取混合标准储备溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成质量浓度为1.0 μg/mL的混合标准工作溶液，于4 ℃下避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品采集与预处理沼液样品采自四川省不同县郊养猪场，多点收集沼液并混合均匀成为一个沼液样品，避光密封，带回实验室在室温条件下保存。

1.3.2 固相萃取净化Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3mL)净化：取10 mL摇匀的沼液于15 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min。吸取5 mL上清液过Oasis HLB固相萃取小柱(使用前用5 mL甲醇和5 mL 水预处理)，待样液完全流出后，用10%甲醇水溶液5 mL淋洗，弃去全部流出液，减压抽干小柱，最后用10 mL甲醇洗脱，将洗脱液氮吹浓缩至干，用2 mL甲醇-水溶液(1∶1，V/V)溶解残渣，过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS/MS法测定。C18固相萃取柱(100 mg/1mL)净化：取10 mL摇匀的沼液于15 mL离心管中，8 000 r/min离心5 min。吸取2 mL上清液过C18 固相萃取小柱(使用前用2 mL甲醇和2 mL水预处理)，待样液完全流出后，用5%甲醇水溶液2mL淋洗，弃去全部流出液，减压抽干小柱，最后用1 mL甲醇洗脱，将洗脱液涡旋混匀，取0.5 mL洗脱液加入0.5 mL水混匀，过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS/MS法测定。

1.4 仪器测定方法

1.4.1 色谱条件色谱柱:Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流动相:A为乙腈，B为含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液；梯度洗脱：0～1.0 min，88%～70%B；1.0～3.0 mim，70%～45%B；3.0～5.0 min，45%～30%B；5.0～5.01 min，30%～88%B；5.01～6.5 min，88%B。流速：0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

1.4.2 质谱条件电喷雾电离，正离子模式(ESI+)；扫描模式：多反应监测(MRM)；雾化气流速：3 L/min；DL温度：300 ℃；加热模块温度：500 ℃；干燥气流速：20 L/min。7种抗生素的MRM参数见表1。

表1 7种抗生素的MRM质谱参数

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

通过全扫描发现7种化合物均能在ESI+下生成较强的[M+H]+准分子离子峰，通过子离子扫描，优化得到各质谱参数(表1)。7种大环内酯类抗生素在C18色谱柱上均有较好的保留，实验选择兼具高分离能力和高耐压性的ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。由于7种化合物极性大小的差异，采用梯度洗脱以缩短分析时间，提高灵敏度。实验比较了7种化合物在乙腈-水、乙腈-0.01%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液等不同流动相条件下的响应强度。结果发现，以乙腈-水为流动相时替米考星和螺旋霉素峰形不好，林可霉素响应值较低；以乙腈-0.01%甲酸水溶液为流动相时替米考星和螺旋霉素的峰形和响应值都得到明显改善，林可霉素的峰响应也显著增强。说明一定的酸性条件能够促进替米考星、螺旋霉素和林可霉素的电离；继续增加流动相中甲酸的含量至0.1%，替米考星和螺旋霉素的峰响应值也稍有增强；当0.1%甲酸水溶液中加入5 mmol/L 甲酸铵时，替米考星和螺旋霉素峰响应略微下降，但流动相中盐的加入使各化合物的保留都有所增强，更有利于混合物的分离。因此，确定以乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液为流动相，梯度洗脱。从7种抗生素在沼液加标样品的提取离子色谱图如图1所示。

图1 7种抗生素在沼液加标样品的提取离子色谱图(1.0 ng/mL)Fig.1 Extracted ion chromatograms of 7 antibiotics spiked in biogas slurry(1.0 ng/mL)

2.2 固相萃取方法的选择和优化

图2 不同固相萃取小柱对7种抗生素回收率的影响(n=3)Fig.2 Effect of different SPE columns on recoveries of 7 antibiotics(n=3)

水体中涉及大环内酯类抗生素的检测基本采用HLB固相萃取柱净化，如郭欣妍等建立了水中林可霉素和4种大环内酯类等多种抗生素的方法[4]；徐洁等测定了水中5种大环内酯类抗生素[14]；唐才明等建立了水体中含3种大环内酯类抗生素的分析方法[15]。本文比较了Oasis HLB小柱(60 mg/3mL)和C18小柱(100 mg/1mL)对7种抗生素平均回收率的影响(图2)。采用Oasis HLB小柱(60 mg/3mL)净化时，螺旋霉素和替米考星回收率偏低，若要获得满意的回收率需将甲醇洗脱体积增加至10 mL以上，不利于快速分析。而采用Bond Elut C18小柱(100 mg/1mL)净化时，7种抗生素回收率均达到80%以上。本文选择Bond Elut C18小柱(100 mg/1mL)净化。此外，为了简化实验步骤，采用C18小柱净化时，将收集的1 mL甲醇洗脱液混匀后，取0.5 mL与0.5 mL水混匀、过滤即可用于测定，而无需将洗脱液浓缩后再复溶，相比文献报道方法更加简单、快速，大大节约了分析时间，提高了分析效率。使用此净化方法在选定的仪器条件下测定，样品基质对目标化合物的定性和定量分析基本无干扰。

2.3 基质效应

参照文献方法[7]，以空白基质(沼液)中标准物质峰面积(A)和甲醇-水溶液(1∶1，V/V)中标准物质峰面积(B)的比值考察基质效应(ME)：ME=A/B×100%，ME<1为基质抑制作用；ME>1为基质增强效应；ME=1则基本无基质效应。结果发现，7种抗生素在沼液基质中的基质效应为0.98～1.47。其中，螺旋霉素和替米考星ME>1.2，其余5种抗生素为0.98

2.4 方法的线性范围、检测限和定量限

吸取适量混合标准工作溶液，用空白样品溶液稀释成质量浓度为0.2、1.0、5.0、50.0、200.0 ng/mL的系列混合基质标准溶液，注入UPLC-MS/MS仪测定，以质量浓度(x)为横坐标、定量离子的峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。分别以信噪比大于等于3和信噪比大于等于10对应的加标浓度作为方法检测限和定量限。结果表明，7种抗生素在0.2～200.0 ng/mL范围内线性关系良好(r>0.997)，检测限为0.1～0.5 ng/mL，定量限为0.2～1.0 ng/mL，结果见表2。

表2 7种抗生素的回归方程、相关系数(r)、检测限(LODs)和定量限(LOQs)

2.5 方法回收率与精密度

在空白样品中添加不同浓度水平的混合标准工作溶液，每个添加浓度设置6个平行，同时作空白对照，按“1.3”方法前处理，按“1.4”仪器条件进行测定，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。由表3可知，螺旋霉素、替米考星在1.0、5.0和50.0 ng/mL添加浓度下，回收率为76.6%～94.1%，RSD为3.5%～12.7%；林可霉素、泰乐菌素、红霉素、交沙霉素和罗红霉素在0.2、1.0、5.0和50.0 ng/mL添加浓度下，回收率为72.5%～100.1%，RSD为2.3%～11.1%。说明该方法准确度较高、重现性较好，适用于沼液中这7种抗生素的测定。

表3 7种抗生素在沼液中的加标回收率和RSDs结果(n=6)

2.6 实际样品测定

利用该方法对四川省不同县郊养猪场的10个沼液样品中林可霉素和6种大环内酯类化合物进行测定，结果检出林可霉素和替米考星2种药物，螺旋霉素、泰乐菌素、红霉素、交沙霉素和罗红霉素在所有样品中均未检出。其中，林可霉素在10个沼液样品中均有检出，浓度在0.20～75.6 ng/mL范围，6个沼液样品中检出替米考星，浓度在0.32～16.8 ng/mL。沼液样品的提取离子色谱图见图3。

图3 沼液样品中林可霉素和替米考星的提取离子色谱图Fig.3 Extracted ion chromatograms of lincomycin and tilmicosin in biogas slurry

3 结论

通过优化色谱、质谱条件和固相萃取净化方法，建立了沼液中林可霉素和6种大环内酯类抗生素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，并进行了方法验证。该方法在固相萃取净化后不需要经过氮吹或旋转蒸发浓缩步骤，准确的同时，更加简单、快速，且节约成本。利用该方法对沼液中林可霉素和大环内酯类抗生素进行分析，掌握沼液中此类抗生素的残留水平和污染状况，为进一步监测其在环境中的传播情况打下基础。