武汉市流感病毒流行特征及检测方法的比较

盛鄂湘，陈良君，段勇威，李一荣

武汉大学中南医院检验科，湖北武汉 430061

流感病毒是引起急性呼吸道感染的主要病原体之一，具有传播途径广，传染性强，极易引起局部流行和暴发大流行等特点。流感病毒属于正黏病毒科,为单股、负链、分节段的RNA病毒。根据核蛋白和基质蛋白的不同，流感病毒可以分为甲、乙、丙、丁4个型别[1]。人感染流感病毒严重者可导致病毒性肺炎、多脏器功能损伤、呼吸衰竭甚至死亡。流感的流行具有明显的季节性，中国的流感疫情暴发主要集中在秋冬季节，南方地区是流感样病例的高发地区[2]。

目前人类无法有效地防控流感的流行，也缺乏可靠的预警、预测手段。每一次流感的大流行，都会对人类健康构成严重威胁和给社会造成巨大的经济损失[3]。因此，应进一步加大流感监测力度，密切关注流感病毒的变异及活动状态[4]。目前，流感患者的临床症状缺乏特异性，一般以轻症感染为主，但也可为重症并导致患者住院甚至死亡[5]，临床医生仅凭临床表现难以确诊，所以实验室病原学检测成为流感的主要诊断依据。流感病毒的检测方法有病毒的分离培养、血清学检测和病毒的快速检测，应用了免疫学和基因检测技术。病毒的分离培养是流感诊断的金标准，常依赖于鸡胚接种，是流感实验室诊断中高度灵敏、准确的方法之一，但鸡胚接种分离周期长，分离效率低[6]。血清学方法是检测流感病毒特异性抗体最常用的方法，如血凝抑制试验(HAI),但灵敏度难以令人满意[7]。胶体金法快速检测是利用抗原抗体反应，然后用胶体金结合物标记达到检测的目的；其优点是快速、简便，大大缩短了检测时间；灵敏、准确，结果受外界因素影响较少；安全简便，不需任何仪器和设备；成本低廉，所需时间和样本量少[8]；但不能检测病毒亚型。临床上大多用此方法来初步快速筛查流感患者。PCR技术可以从核酸水平检测病毒，具有高灵敏度、特异度和较高的检出率，检测标本用量少，在病毒感染诊断中发挥着重要作用。

本研究对武汉市甲型流感(以下简称“甲流”)、乙型流感(以下简称“乙流”)的流行病学特征进行了分析；选取600份经流感病毒胶体金法检测的标本，然后用巢式PCR来进行结果复核，旨在评价胶体金法检测的灵敏度和特异度能否满足流感患者初筛或诊断的要求。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据《全国流感监测方案(2010年版)》中流感样病例的定义：发热(体温≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛者，将2017—2019年因流感样症状于本院就诊的患者共60 944例纳入研究，采集患者的鼻咽拭子标本，在检验科门诊进行流感病毒胶体金法检测；选取其中的600份样本，采用巢式PCR检测对结果进行复核。

1.2方法

1.2.1咽拭子标本的采集和保存 将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁，上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，避免触及舌部。采集完拭子后，迅速将其放入采样管(内含3～4 mL标本保存液)中，弃去尾部，旋紧管盖并密封，保存至-70 ℃冰箱。

1.2.2流感病毒胶体金法检测 应用广州万孚生物技术股份有限公司生产的甲/乙型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)对甲/乙型流感病毒抗原进行检测，严格按照试剂盒检测说明书进行操作并在有效期内使用。

1.2.3流感病毒的巢式PCR检测 采用美国TRIzol即用型试剂提取咽拭子标本的核酸，按照实验室标准操作流程进行。以武汉大学基础医学院病毒研究所实验室提供的特异性引物和扩增条件进行第一轮扩增：引物序列，上游为GAYCCNCCNTACAGCCATGG，下游为AYCCTCTNATTTGCATYCCNGG；扩增条件如下，50 ℃ 30 min，94℃ 3 min，94℃ 45s、52 ℃ 45s、72℃ 50 s(36个循环)，72℃ 10 min。第二轮扩增：引物序列，上游为ACNGGNTAYACNATGGACACRGT，下游为PB1_679R CCTCTYTCNGCRTCYTTNGTCAT；扩增条件如下，94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s、52 ℃ 40 s、72 ℃ 45 s(36个循环)，72 ℃ 10 min。制备1%琼脂糖凝胶，取5 μL第二轮扩增产物，在120 U的电压下，电泳20 min，在526 bp对应区段出现阳性条带者为检测阳性。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用Kappa一致性检验分析两种方法的一致性：若Kappa为0.0～<0.20，则一致性极低；若Kappa为0.20～0.40，则一致性一般；若Kappa为>0.40～0.60，则一致性中等；若Kappa为>0.60～0.80，则一致性高；若Kappa为>0.80～1.00，则几乎完全一致。

2 结 果

2.12017—2019年流感病毒检测的总体情况 2017—2019年，各年份中甲流、乙流、混合感染检出率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 武汉市2017—2019年流感病毒的流行情况[n(%)]

2.2流感病毒检出例数在不同月份的分布特点 2017年的检出高峰为8月、9月和12月；2018年的检出高峰为12月、1月和2月；2019年与2017和2018年比较，检测总例数增加，从而各月份的检出例数有所增加，且检出高峰集中在1月、2月和12月；见图2。

图2 2017—2019年流感病毒检出例数在不同月份的分布情况

2.3不同年龄患者的流感病毒感染情况 6岁以下及6～18岁的人群的流感病毒检出率较高，分别为24.53%和27.26%，各年龄段之间比较，差异有统计学意义(χ2=1 490.85，P<0.05),见表2。

表2 2017—2019年不同年龄段患者的流感病毒检出率

2.4流感病毒胶体金法和巢式PCR检测结果的比较 选取2018年1月份采集的600份流感样病例的标本，采用巢式PCR检测进行复核。两种方法一致性检验的Kappa系数为0.40，一致性一般。见表3。

表3 胶体金法与巢式PCR检测的结果

3 讨 论

流行性感冒是由于流感病毒感染人或动物，导致其急性发病的一类以上呼吸道症状为特点的疾病。参与流感病毒复制的RNA聚合酶没有校正功能，所以流感病毒会频繁地出现基因突变。流感病毒具有节段分布的结构特点，易导致基因重组，亦称抗原漂移[9]，这种变异易发生于甲型流感病毒，导致产生新的病毒亚型，人类历史上多次流感流行或暴发均与其相关[10]。乙型流感病毒只有一种型别，病毒变异少，其感染者为散发病例。本研究中，甲流检出率高于乙流，混合感染的检出率最低。流感病毒的流行具有明显的季节性，北方流行均发生在冬春季，而南方大部分发生在秋冬季或夏季[11]。本研究中，流感也具有季节流行性。

流感病毒的易感人群为老年人、儿童、慢性病人群，以及免疫功能受到抑制者[12]。本研究对不同年龄段人群的病毒感染情况的分析表明，阳性患者中18岁以下的人群所占比例最高，特别是6岁以下的婴幼儿，为流感病毒的主要传播对象；而45岁以上的中年和老年人所占比例较低。这可能与就诊习惯有关，婴幼儿和青少年以发热和上呼吸道感染症状作为初始就诊原因的比例较高，较易筛查出流感病例，而中年人和老年人则以其他主诉症状为就诊原因的居多。对儿童和有基础疾病的老年人均应加强防护措施，及时接种疫苗，预防流感。

流感病毒感染者的症状不明显，临床诊断主要依赖于实验室检测，可引起人类呼吸道感染的病毒有200余种，因此检测试剂和方法的灵敏度和特异度对临床诊断尤为重要。巢式PCR的检测具有高特异度，和定量PCR相比，灵敏度提高了，可以减少假阴性结果的出现，有助于临床治疗[13]。而流感病毒快速检测试剂具有操作简单、快捷，分析结果清楚、易于判断，且不需要任何仪器、成本低廉等优点，非常适用于临床大量标本的初筛[14]。本研究中，胶体金法和巢氏PCR检测结果的一致性一般，具有较高的灵敏度和特异度。假阴性出现的原因可能为胶体金法检测依赖于抗原的表达，病毒感染初期和后期受自身免疫系统清除的影响，抗原的表达量低，未达到试剂盒的检测限。当临床流感症状明显而胶体金法检测阴性时，应进一步检测。出现假阳性的原因可能是包被的病毒抗体纯化不够，导致其和非特异性病毒发生交叉反应。本课题组后续还将胶体金法检测结果为假阴性的118例样本送去测序，发现其中80.95%为甲型H1N1，1.20%为甲型H3N2,14.29%为甲型H5N6，3.60%为乙型流感，表明漏检的样本主要是甲流H1N1,为临床医生提供了一定的判断依据，同时本研究中发现巢氏PCR检测存在一定的污染，应注重实验人员的操作技能和专业培训。

流感的发生具有明显的季节性，发病率具有上升的趋势，好发于秋冬季，应加强流感病毒变异的监测和防控。6岁以下的婴幼儿是流感的高发和易感人群，应及时接种疫苗，加强管理。胶体金法检测操作快速、简便，能基本满足对临床大量标本进行初筛和诊断的要求，但还应不断提高灵敏度和特异度，为流感病毒的早期、准确筛查提供更有效的帮助。