巢式聚合酶链反应检测男性尿道炎患者尿液中阴道毛滴虫

乐文静 苏晓红 李赛 刘玉荣 张津萍 朱小凤 王宝玺

巢式聚合酶链反应检测男性尿道炎患者尿液中阴道毛滴虫

乐文静 苏晓红 李赛 刘玉荣 张津萍 朱小凤 王宝玺

目的建立两种巢式聚合酶链反应(PCR)方法检测男性尿道炎患者尿液中阴道毛滴虫感染状况,评价两种巢式PCR在临床诊断中的应用价值。方法2011年4月至2013年12月来我院性病门诊就诊的1 088例男性尿道炎患者为研究对象,收集尿道拭子标本做分泌物涂片镜检、阴道毛滴虫湿片检测以及淋球菌培养,同时收集尿液标本提取DNA,针对阴道毛滴虫重复基因组和β微管蛋白基因,采用两种巢式PCR法检测尿液中阴道毛滴虫。结果湿片法检测阴道毛滴虫的阳性率为0,而两种巢式PCR法均检测出29例阳性标本,阳性率为2.67%,且两种巢式PCR法检测出的阳性标本一致。结论与湿片法相比,巢式PCR法检测男性尿液标本阴道毛滴虫具有较高的灵敏度和特异性。

尿道炎;毛滴虫,阴道;聚合酶链反应

据世界卫生组织(WHO)报道[1],2008年阴道毛滴虫病新发病例仅西太平洋地区就达4.57千万,其中男性2.38千万。目前实验室检查毛滴虫的方法主要为湿片法,但敏感性低,且易受检验者水平的影响。培养法虽然是诊断毛滴虫感染的金标准,但操作麻烦,耗时较长,故不作为临床常规检查[2-3]。聚合酶链反应(PCR)法对尿拭子或尿液标本均具有较高的敏感性和特异性[4-5],但巢式PCR与普通PCR法相比,通过设计外引物和内引物,对目的基因进行两轮特异性扩增,可进一步提高检测结果的灵敏度和特异性[6]。鉴于以上原因,本研究参考相关文献,建立了两种巢式PCR方法,对男性尿道炎患者的尿液标本进行检测,以期为临床阴道毛滴虫的检测提供行之有效的方法。

对象与方法

一、研究对象

2011年4月至2013年12月,在中国医学科学院皮肤病医院性病门诊就诊的有尿道炎临床表现的男性患者1 088例。病例选择标准:年龄≥18岁,有尿道分泌物和(或)尿痛,就诊前未应用抗滴虫药物。本研究通过中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

二、主要试剂与仪器

淋球菌TM培养基(珠海迪尔生物工程有限公司),DNA提取液(美国Epicentre公司),PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司],核酸分子量标准[生工生物工程(上海)股份有限公司],琼脂糖(美国Life Technologies公司)。S1000型PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统(美国BioRad公司),高速低温离心机(德国Eppendorf公司)。

三、方法

1.标本采集:每例患者采集2根尿道拭子标本,1根用于分泌物涂片镜检和淋球菌培养,另1根用于阴道毛滴虫湿片镜检[7];采集长时间(1 h以上)未排尿后的首段尿或清晨首次尿5～10 ml,分装成1 ml/管后于-80℃保存,用于DNA提取。

2.阴道毛滴虫湿片法检测:将采集的拭子直接涂在滴有生理氯化钠溶液的载玻片上,盖上盖玻片,用100倍、400倍显微镜观察。

3.DNA提取:将-80℃冻存的尿液置37℃解冻,4℃离心3 min(12 000 r/min,离心半径9.5 cm)。弃上清液后加200 μl DNA提取液,充分涡旋15 s,置65℃金属浴15 min。再涡旋15 s,97℃金属浴5 min。取出冷却后离心取上清进行PCR检测。

4.巢式PCR引物设计:TVC巢式PCR引物参考文献[6],以阴道毛滴虫重复基因组为目的基因,扩增片段约237 bp;BTuBx巢式PCR引物以阴道毛滴虫β微管蛋白为目的基因,参考文献[8]并运用Primer Premier 5.0生物软件自行设计,扩增片段约134 bp。两种阴道毛滴虫巢式PCR引物序列见表1。

5.PCR检测:配制50 μl PCR扩增体系,10×PCR 缓冲液(Mg2+Plus)5 μl,dNTPs(各 10 mmol/L)1 μl,引物(TVC3F/TVC4R 或 BTuBx1-Fa/BTuBx1-Ra)各 1 μl,Taq 酶(5 U/μl)0.25 μl,DNA 模板 5 μl,其余体积用灭菌蒸馏水补齐。每次检测均设阳性对照(经测序及BLAST比对验证序列正确的PCR阳性男性尿液DNA)、阴性对照(无菌蒸馏水)。取0.5 μl第1轮扩增产物作为DNA模板,引物(TVC11F/TVC12R 或 BTuBx3-F/BTuBx3-Ra)各 1 μl,其余成分同上,进行第2轮扩增。第1轮或第2轮PCR扩增过程相同,均包括40个循环:95℃变性1 min,52～55℃退火1 min,72℃延伸1 min。琼脂糖凝胶电泳:配制2%琼脂糖凝胶,加入1%EB溶液,制成约4 mm厚的琼脂板,于电泳槽中电泳。电泳液为1×TAE溶液,电压120 V,每孔上样量10 μl。电泳后将琼脂板置于紫外线下观察,拍照记录结果,扩增出相应大小目的条带即为阳性(图1)。

表1 阴道毛滴虫巢式PCR引物序列

6.核酸序列测定及分析:将阳性PCR产物送至北京博迈德生物技术有限公司进行序列测定,得到的核酸序列与GenBank中已知目的基因序列进行BLAST比对分析。

7.统计学处理:结果数据用SPSS 22.0统计软件进行Fisher精确概率法检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两种巢式PCR扩增产物的鉴定

两种巢式PCR产物经测序分析以及BLAST比对,与GenBank中预期片段序列相似性达98%以上。

二、两种巢式PCR法及湿片法的比较

图1 阴道毛滴虫巢式PCR琼脂糖凝胶电泳图谱 M:DNA Marker;1～3:待测标本;4:阳性对照;5:阴性对照;A:TVC巢式PCR结果;B:BTuBx巢式PCR结果

采用两种巢式PCR法及湿片法分别检测了1 088例男性尿道炎患者尿液,结果湿片法的检出率为0,而两种巢式PCR法均检测出29例阳性标本,阳性率为2.67%,且两种巢式PCR法检测出的阳性标本一致。以并联法计算各实验方法的灵敏度,即只要有一种方法检测结果为阳性即认定该标本为阳性,湿片法灵敏度为0,两种巢式PCR法灵敏度均为100%。以串联法计算两种巢式PCR法的特异度,即只有当两种巢式PCR均检测为阳性时才认定该标本为阳性,两种巢式PCR法的特异性均为100%。经Fisher精确概率法检验分析,两种巢式PCR法检出率分别与湿片法比较,差异均有统计学意义(P＜0.01)。

讨 论

阴道毛滴虫病是世界范围内常见的性传播疾病。但由于检测技术的限制,以及超过77.3%的男性感染者无明显临床症状[9],使得人们习惯上认为该病是女性阴道炎的常见病因,而对男性感染者的诊断与治疗常常被忽视。我国性病门诊中男性阴道毛滴虫检出率0～10.09%[10-12]。何康[13]对215例滴虫性阴道炎女患者的男性配偶尿道分泌物进行阴道毛滴虫湿片镜检,阳性率高达20%。

姚志远等[5]曾以培养法为金标准,证实PCR法对尿道拭子或尿道液标本均具有较高的敏感性和特异性。我们首次运用巢式PCR法进行男性尿道炎中阴道毛滴虫的检测。巢式PCR法与普通PCR法相比,通过设计外引物和内引物,对目的基因进行两轮特异性扩增,大大提高了检测结果的灵敏度和特异性,尤其是对于临床含有大量人体正常基因而病原体含量过少的标本,更是减少了漏检的概率。本研究中巢式PCR检测出29例阳性标本,第1轮PCR的阳性检出率仅为55.17%～58.62%(TVC引物及BTuBx引物第1轮分别检出阳性标本17例、16例,该数据未在上述结果中列出)。本研究中湿片法阳性检出率为0。表明巢式PCR法与湿片法、普通PCR法相比,具有更高的灵敏度和特异性。

阴道毛滴虫虽然不是男性尿道炎的常见原因,对于有尿道炎症状的男性患者如果经验性治疗没有效果,有条件时应做滴虫检测。湿片法虽然快速简便,但其敏感性低,增加了临床漏检的可能性,宜推广灵敏度和特异性均高的PCR法检测男性标本中的阴道毛滴虫。

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[4]Schwebke JR，Lawing LF.Improved detection by DNA amplification ofTrichomonas vaginalisin males[J].J Clin Microbiol，2002，40(10):3681-3683.

[5]姚志远，郑和义.培养法及聚合酶链反应检测男性非淋菌性尿道炎患者中阴道毛滴虫[J].中华皮肤科杂志，2003，36(1):41-43.

[6]Bandea CI，Joseph K，Secor EW，et al.Development of PCR assays for detection ofTrichomonas vaginalisin urine specimens[J].J Clin Microbiol，2013，51(4):1298-1300.

[7]叶顺章.性传播疾病的实验室诊断[M].2版.北京:科学出版社，2009:140-141.

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[12]邱木雄，程力明.1 281例性病门诊患者阴道毛滴虫感染分析[J].中国麻风皮肤病杂志，2009，25(5):399-400.

[13]何康.男性毛滴虫性尿道炎215例致病情况调查[J].临床皮肤科杂志，2004，33(1):19.

2014-03-19)

(本文编辑:颜艳)

Detection ofTrichomonas vaginalisin male patients with urethritis by nested PCR

Le Wenjing，Su Xiaohong，Li Sai，Liu Yurong，Zhang Jinping，Zhu Xiaofeng，Wang Baoxi.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Su Xiaohong，Email:suxhong@yahoo.com

ObjectiveTo establish two nested PCR assays for detection ofTrichomonas vaginalisin urine samples from male patients with urethritis，and to evaluate their diagnostic value.MethodsOne thousand and eighty-eight male patients with urethritis were enrolled from sexually transmitted disease(STD)clinic in the Hospital of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College between April 2011 and December 2013.Urethral swabs were collected followed by smear testing，wet mount microscopic examination ofTrichomonas vaginalis，and cultivation ofNeisseria gonorrhoeae.Urine specimens were also obtained from these patients followed by DNA extraction.Two nested PCR assays were developed and performed to amplify the repeat genomic sequence and β-tubulin gene ofTrichomonas vaginalis.ResultsTrichomonas vaginaliswas detected in none of these swab specimens by wet mount microscopy，but in 29(2.67%)of the urine specimens by either of the two nested PCR assays.Moreover，the positive specimens detected by the two nested PCR assays were completely consistent.ConclusionCompared with wet mount microscopy，nested PCR has higher sensitivity and specificity in detection ofTrichomonas vaginalisin urine samples from male patients.

Urethritis;Trichomonas vaginalis;Polymerase chain reaction

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.004

美国国立卫生研究院(NIH)国际合作项目(1-U19-AI084048)

210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所

苏晓红,Email:suxhong@yahoo.com