寻常性银屑病患者外周血Th22细胞及其白细胞介素22的表达

陈永锋 辛甜甜 王晓华 陈文静 蔡碧珊 薛耀华

寻常性银屑病患者外周血Th22细胞及其白细胞介素22的表达

陈永锋 辛甜甜 王晓华 陈文静 蔡碧珊 薛耀华

目的探讨寻常性银屑病患者外周血Th22细胞及相关因子白细胞介素22(IL-22)表达水平与疾病严重程度及病程的相关性。方法抽取40例寻常性银屑病患者和30例健康对照者外周血,流式细胞仪检测外周血Th22细胞比例,ELISA法检测血清中IL-22的表达。采用t检验、Pearson相关分析法进行分析。结果寻常性银屑病患者外周血Th22细胞百分比(0.65%±0.48%)高于健康对照组(0.33%±0.15%),两组差异有统计学意义(t=3.89,P＜0.01);银屑病患者Th22细胞与银屑病病情严重度评分(PASI)呈正相关(r=0.38,P＜0.05),但与病程无相关性(r=0.20,P＞0.05)。银屑病患者血清中IL-22表达水平[(67.96±14.32)ng/L]高于健康对照组[(40.59±9.91)ng/L],两组差异有统计学意义(t=9.45,P＜0.01);银屑病患者血清IL-22表达水平与PASI呈正相关(r=0.94,P＜0.01),与病程无相关性(r=0.10,P＞0.05)。结论Th22细胞及IL-22在寻常性银屑病外周血中有高表达,且Th22细胞及IL-22水平均与疾病严重程度相关。

银屑病;CD4+T细胞;Th22细胞;白细胞介素22

Th22是近年来发现的一种不同于Th1、Th2及Th17的新型CD4+T细胞,特征性地表达CCR6、CCR4和CCR10,分泌白细胞介素22(IL-22)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α),而不产生 IL-4、IL-17和干扰素γ(IFN-γ)[1-3]。Th22具有独立的分化和发育调节机制,在自身免疫性疾病、感染性疾病以及组织修复中发挥重要调节作用。我们用流式细胞仪检测银屑病患者外周血Th22细胞的表达,并用ELISA检测血清中IL-22的水平,探讨Th22细胞及相关因子IL-22与银屑病的相关性。

病例与方法

一、临床资料

入选病例为2011年8月至2012年5月在广东省皮肤病医院门诊及住院部确诊的寻常性斑块状银屑病(以下简称银屑病)患者40例,其中男24例,女16例,年龄21～63岁,平均(36.63±9.28)岁;病程4个月至10年,平均(2.67±2.37)年;银屑病病情严重度评分(PASI)[4]5.7～26.2,平均12.44±4.85。所选病例均符合《临床皮肤病学》第3版[5]诊断标准,所有患者近3个月内未系统使用糖皮质激素及免疫抑制剂,1个月内未外用糖皮质激素或其他制剂或接受紫外线照射等治疗,无合并先天或获得性自身免疫性疾病及其他免疫相关性或炎症性、真菌感染疾病。对照组为健康体检者30例,其中男17例,女13例,年龄23～53岁,平均年龄(35.30±8.43)岁;观察前1个月内无细菌、真菌、病毒感染,既往无银屑病等免疫相关皮肤疾病。患者组及健康对照组的性别及年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究通过广东省皮肤病医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

二、试剂和仪器

美国eBioscience公司生产的藻多甲素-叶绿素蛋白5.5(PerCP-Cy5.5) 抗人CD3、Alexa Fluor 488抗人CD8、藻红蛋白(PE)抗人IL-22、别藻蓝蛋白(APC) 抗人 IL-17、PE-Cy7 抗人 IFN-γ、PE 、APC、PE-Cy7鼠IgG1 K同型对照。美国Sigma公司生产的佛波酯肉豆蔻酸乙酸盐(PMA)、离子霉素、蛋白转运抑制剂(BFA)。联科生物科技有限公司生产的IL-22 ELISA试剂盒、FIX&PERM。美国BD公司生产的FACS CantoⅡ型流式细胞仪。

三、方法

1.外周血Th22细胞的流式细胞仪计数:采集受检者静脉血2 ml,肝素钠抗凝,24 h内检测。取试管1支,加入RPMI 1640细胞培养液和抗凝血各150 μl,再加入 50 mg/L 离子霉素工作液 6 μl、1 mg/L PMA 工作液 7.5 μl、0.5 g/L BFA 工作液 6 μl,混匀,置37℃、5%CO2培养箱内培养5 h,然后取出混匀;取2支试管,A管为实验管,B管为同型管,各加入上述混匀液100 μl,再加入PE-Cy5-CD3和FITC-CD8各5 μl,室温避光孵育15 min;然后两管分别加入Fix&Perm中的Reagent A(即固定剂)100 μl,室温避光孵育15 min;加入磷酸盐缓冲液(PBS)3 ml,400×g离心5 min,弃上清,再加入FIX&Perm中的Reagent B(即破膜剂和溶血剂)100 μl,静置3 min;然后A管中加入PE-Cy7-IFN-γ、APCIL-17、PE-IL-22 各 5 μl,B 管中加入 PE-Cy7-IgG1、APC-IgG1、PE-IgG1 各 5 μl,室温避光孵育 30 min;然后两管均加入PBS 3 ml,400×g离心5 min,弃上清,用PBS 400 μl重悬细胞,上机检测。以FSC/SSC设门,收集20 000个淋巴细胞,圈定淋巴细胞析,检测结果以±s表示,采用成组t检验分别比较两组外周血Th22细胞比例和血清IL-22水平差异,采用Pearson相关分析法进行相关性分析,P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、外周血Th22细胞比例及血清IL-22表达水平

银屑病患者组外周血Th22细胞比例(0.65%±0.48%)高于健康对照组(0.33%±0.15%),两组比较差异有统计学意义(t=3.89,P＜0.01),见图1。银屑病患者组血清IL-22表达水平[(67.96±14.32)ng/L]高于健康对照组[(40.59±9.91)ng/L],两组比较差异有统计学意义(t=9.45,P＜0.01)。

二、相关性分析结果

银屑病患者外周血Th22细胞比例及血清IL-22水平与PASI评分(12.44±4.85)均呈显著正相关(r值分别为0.38和0.94,P＜0.05和 ＜0.01),而与患者病程(2.67±2.37年)均无显著相关性(r值分别为0.20和0.10,均P＞0.05)。

讨 论

Th22细胞是近几年发现的新型CD4+记忆性T细胞亚群[1-3]。越来越多的证据表明,Th22细胞在自身免疫性疾病、炎症性疾病以及组织修复中发挥重要作用[8-10]。目前发现此细胞参与银屑病发病主要是通过分泌IL-22等炎症因子作用于角质形成细胞起作用,包括促进角质形成细胞过度增殖,抑制角质形成细胞的正常分化以及分泌及诱导相关因子群为R1,在R1门内以CD3+/SSC设门,圈定T淋巴细胞为R2,在R2门内以CD3/CD8表达的散点图中,圈定CD3+/CD8-的T淋巴细胞为R3,在R3门内收集表达CD8-/IL-22+的细胞,即为CD3+CD4+IL-22+细胞群(通常以佛波酯、离子霉素刺激后CD4的表达会降低,以荧光观测CD3+CD4+IL-22+比较困难,而CD8刺激后表达降低不明显,因此用CD3+CD8-/IL-22+来代表CD3+CD4+/IL-22+细胞[6-7]);再分别以IL-17和IFN-γ设门,得到CD3+CD8-IL-22+IL-17-IFN-γ-的T淋巴细胞群即为Th22细胞,以荧光抗体染色阳性细胞的百分率记录结果。

2.血清中IL-22的检测:采集受检者静脉血3 ml,静置留取血清500 μl,置-20℃保存待检。严格按照ELISA试剂盒说明书检测,用ELISA软件绘制标准曲线并计算其浓度。

3.统计学分析:用SPSS17.0软件进行统计分参与炎症反应,从而引发银屑病特征性皮损[11-15]。

图1 银屑病患者与健康对照组外周血Th22细胞流式细胞仪分析散点图 银屑病患者组血清IL-22的表达水平高于健康对照组,Th22细胞比例高于健康对照组 上图为银屑病患者组,下图为健康对照组

我们采用流式细胞仪检测银屑病患者和健康对照者外周血CD4+T细胞中Th22细胞比例,检测发现,银屑病患者外周血Th22细胞较健康对照组高(图1),提示Th22细胞参与银屑病发病,与目前国外研究结果一致[3，10，16]。 虽然研究认为Th22主要定位于皮损[10],外周血较少,但与健康对照组相比差异仍有统计学意义。此外,将Th22细胞及其相关因子IL-22表达水平与PASI评分、病程作相关性分析发现,Th22细胞、IL-22均与PASI评分成正相关,提示Th22细胞、IL-22可反映疾病的严重程度,或许在后续治疗中可通过监测Th22细胞及IL-22水平的变化来评价疗效。而Th22细胞、IL-22水平均与病程无相关性,可能是由于Th22及IL-22主要参与银屑病皮损形成及发展,当疾病缓解皮疹消退时,Th22细胞或IL-22水平即降低[17],而并非随病程迁延而长期存在,但具体机制还有待于进一步研究。

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2014-03-24)

(本文编辑:周良佳 颜艳)

Frequency of T helper type 22 cells and expression of interleukin-22 in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris

Chen Yongfeng*，Xin Tiantian，Wang Xiaohua，Chen Wenjing，Cai Bishan，Xue Yaohua.*Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou 510091，China

Chen Yongfeng，Email:gdcyf@163.com

ObjectiveTo determine the frequency of T helper type 22(Th22)cells and expression level of interleukin-22(IL-22)in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris，and to investigate their relationship with disease severity and clinical course.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 40 patients with psoriasis vulgaris and 30 healthy human controls.Five-color flow cytometry was performed to determine the percentage of Th22 cells in peripheral blood，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the expression of serum IL-22.Statistical analysis was carried out byttest and Pearson correlation analysis.ResultsBoth the percentage of Th22 cells and serum level of IL-22 in peripheral blood were significantly higher in patients with psoriasis vulgaris than in healthy human controls(Th22 cells:0.65% ±0.48%vs.0.33% ±0.15%，t=3.89，P＜0.01;IL-22:(67.96 ± 14.32)vs.(40.59 ± 9.91)ng/L，t=9.45，P＜ 0.01).Further more，Th22 cell percentage and IL-22 serum level in peripheral blood were both positively correlated with psoriasis area and severity index(PASI)in these patients(r=0.38，0.94，P＜ 0.05 and 0.01，respectively)，but neither of them correlated with clinical course of psoriasis vulgaris(r=0.20，0.10，respectively，bothP＞ 0.05).Conclusions The percentage of Th22 cells and level of IL-22 are increased in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris，and both of them are correlated with disease severity.

Psoriasis;CD4-positive T-lymphocytes;Th22 cells;Interleukin-22

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.005

广东省2010年第一批产业技术研究与开发资金计划项目(2010B031600115)

510091广州,广东省皮肤病医院(陈永锋、王晓华、陈文静、蔡碧珊、薛耀华);广州医科大学附属第三医院皮肤科(辛甜甜)

陈永锋,Email:gdcyf@163.com