二代测序技术在东南亚缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血夫妇胚胎植入前遗传学检测中的应用

何天文，周伟宁，卢 建，李静姝，陈创奇，董云巧，杜 丽，尹爱华△

广东省妇幼保健院：1.医学遗传中心；2.广东省妇幼代谢与遗传病重点实验室；3.生殖中心，广东广州 511443

珠蛋白生成障碍性贫血(以下简称“地贫”)主要分为α地贫和β地贫两种类型[1]。α地贫发病机制主要是α珠蛋白基因的缺失，在我国主要分布于广东、广西和海南等南方地区，以东南亚缺失型α地贫(――SEA/αα)最为常见[2-4]。如果夫妻双方为东南亚缺失型α地贫，每次妊娠胎儿均有25%的可能性为重型α地贫，又称巴氏水肿胎。巴氏水肿胎无法存活，还严重危害母体健康，同时给家庭与社会带来沉重负担[5]。产前诊断和胚胎植入前遗传学检测(PGT)是预防重度地贫患儿出生的重要措施。近年来随着二代测序(NGS)技术的飞速发展,基因测序成本不断降低，临床应用领域不断扩大。目前NGS已经成为PGT的主要检测手段之一[6-7]。本研究采用NGS技术对胚胎――SEA区域直接测序和构建胚胎单核苷酸多态性(SNP)单体型连锁分析对东南亚缺失型α地贫夫妇进行PGT，以避免重型α地贫胎儿的形成。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取1对2017年12月于广东省妇幼保健院就诊的东南亚缺失型α地贫不孕不育夫妇。为了寻求辅助生殖和避免重型α地贫胎儿的形成，这对夫妇要求行第三代试管婴儿治疗。这对夫妇中，男方34岁，为东南亚缺失型α地贫，基因型为――SEA/αα；女方26岁，为东南亚缺失型α地贫，基因型为――SEA/αα，2013年结婚至今未孕，超声提示左侧卵巢有个大小为78 mm×55 mm的囊肿，囊肿破坏毗邻的卵巢组织的卵泡结构导致卵巢储备功能下降。向该夫妇充分介绍第三代试管婴儿治疗过程及相关风险后，该夫妇签署知情同意书并接受PGT。本研究经广东省妇幼保健院生殖医学伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 广州米基科技发展有限公司的磁珠法血液基因组提取试剂盒、胚胎植入前单基因病检测建库试剂盒、胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒(北京中仪康卫医疗器械有限公司)，PCR-流式荧光杂交法地贫基因检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)，Verity梯度PCR仪、ABI3730测序仪(美国ABI公司)、MiSeq高通量测序仪(美国Illumina公司)、MAGPIX液相芯片分析仪(德国Luminex公司)、全基因组扩增试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1夫妇及双方父母地贫基因检测 抽取夫妇及双方父母外周血各2 mL(EDTA抗凝)，使用血液基因组提取试剂盒进行外周血基因组DNA的提取，严格按照试剂盒说明书进行基因组DNA提取操作。使用PCR-流式荧光杂交法地贫检测试剂盒检测夫妇及双方父母的地贫基因，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.2家系成员SNP单体型的构建 以――SEA区域[HBA2基因(NM_000517.4)、HBA1基因(NM_000558.4) chr16:215400-234700正向转录]为目标区域，在――SEA区域的上游234 kb区域内选择143个高密度紧密连锁的SNP作为遗传标记，下游2 Mb区域选择100个作为遗传标记。利用Ion AmpliSeq Designer网站设计引物，对――SEA区域和高密度紧密连锁的SNP进行多重PCR扩增，多重PCR产物经纯化和建库进行NGS，选择有效SNP位点对构建家系成员的单体型进行连锁分析，确定夫妇是否携带有致病风险的染色体。

1.3.3植入前遗传学诊断 采用卵细胞质内单精子注射(ICSI)方式进行授精。胚胎发育第3天时用激光脉冲在透明带上切割一裂口，将胚胎转移至囊胚培养液中继续培养。胚胎发育第5、6天时观察到囊胚形成且脱出裂口滋养层细胞数在5～10个时进行活检。对活检获得的囊胚滋养层细胞采用全基因组扩增试剂盒进行胚胎细胞全基因组扩增(WGA)。全基因组扩增成功的产物通过多重PCR扩增――SEA区域[HBA2基因(NM_000517.4)、HBA1基因(NM_000558.4) chr16:215400-234700正向转录]和高密度紧密连锁的SNP，多重PCR产物经纯化和建库后进行NGS。通过Sanger测序验证――SEA区域NGS结果。对正常和东南亚缺失型α地贫的胚胎进行了低深度的染色体非整倍性筛查，以排除有携带染色体拷贝数异常的胚胎。

1.3.4产前诊断 选择正常且发育良好的整倍体胚胎于冻融胚胎周期进行移植。于胚胎移植后14 d检测血人绒毛膜促性腺激素(HCG)以确定是否妊娠，于胚胎移植后4周行经阴道B超确定是否临床妊娠，于孕18～24周时行羊膜腔穿刺进行染色体核型分型和α地贫基因产前检测来验证PGT结果。

2 结 果

2.1夫妇及双方父母地贫基因检测结果 提取外周血基因组DNA后，采用PCR-流式荧光杂交法对夫妇及双方父母的地贫基因进行检测，男方的――SEA来源于父亲，女方的――SEA来源于母亲，见表1。

表1 夫妇及双方父母地贫基因检测结果

2.2家系成员SNP单体型的构建 多重PCR扩增――SEA区域和高密度紧密连锁的SNP后，经过NGS后，选择了106个有效SNP位点成功构建了家系成员SNP单倍型，连锁分析后确定夫妇致病的风险染色体，见表2。

表2 夫妇α珠蛋白基因有效SNP位点数和分布(n)

2.3植入前遗传学诊断 获卵28个，其中成熟卵子23个，予以ICSI后得到正常受精卵20个。所有正常受精卵均发生卵裂，第5天观察有7枚囊胚符合活检标准，活检后进行胚胎玻璃化冷冻保存，活检产物标记为D501、D502、D503、D504、D505、D506和D507；第6天观察有6枚囊胚符合活检标准，活检产物标记为D601、D602、D603、D604、D605和D606，每个样本活检细胞数为5～10个。对活检获得的囊胚滋养层细胞进行全基因组扩增，13个囊胚中12个全基因组扩增成功，其中D504标本全基因组扩增失败。对全基因组扩增成功的标本进行多重PCR扩增――SEA区域和高密度紧密连锁的SNP，产物纯化、建库后行NGS。对胚胎――SEA区域直接测序和构建胚胎SNP单体型连锁分析，结果显示12个囊胚中4个为正常(αα/αα)，7个为东南亚缺失型α地贫(――SEA/αα)，1个为重型α地贫(――SEA/――SEA)。利用Sanger测序进行进一步验证，结果与NGS结果一致，见表3。11个正常和东南亚缺失型α地贫囊胚中有8个为整倍体，3个为非整倍体，见表4。

2.4产前诊断 选择正常和发育良好的整倍体胚胎(D506)于女方的第3个月经周期进行囊胚解冻移植。移植后14 d检测外周血HCG为594.4 mIU/mL；移植后40 d经阴道超声见单个孕囊，孕囊大小18～11 mm，胚芽长约3 mm，可见心管搏动。孕19周经羊膜腔穿刺进行产前诊断的结果显示胎儿地贫基因型为αα/αα，胎儿染色体G显带核型没有发现异常，与PGT结果一致。足月顺产分娩一男婴，健康状况良好。

3 讨 论

地贫是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，主要分布于热带和亚热带地区，其中α地贫主要分布于东南亚、中国南方和少数非洲地区[8]。我国广西与广东两地做过大样本、辖区全覆盖的地贫分子流行病学调查，其中广西壮族自治区流调数据显示广西α地贫基因携带率为17.55 %，东南亚缺失型α地贫携带率为7.85%[9]，而广东省的流调数据显示广东省α地贫基因携带率为13.31 %，其中东南亚缺失型α地贫携带率为6.85%，夫妻为同型地贫的携带率为1.87%[10]。如果夫妻双方为东南亚缺失型α地贫，每次妊娠均有25%的可能性为重型α地贫，又称巴氏水肿胎。巴氏水肿胎可导致孕妇各种并发症的发生，如妊娠高血压和产后大出血等，危及孕妇的生命。重型地贫具有致死致残性，且治疗费用高昂，通过产前诊断和胚胎植入前遗传学诊断可以预防重度地贫患儿的出生[11-13]。绒毛穿刺术、羊膜腔穿刺术和脐带穿刺术等传统产前诊断技术不但具有有创性，而且具有一定的导致孕妇流产的风险。东南亚缺失型α地贫夫妇经产前诊断确诊胎儿为重型地贫后，需要选择终止妊娠，对孕妇本人及其家庭也造成了一定的生理和心理负担。PGT是在胚胎植入前对胚胎染色体及遗传致病基因进行检测，选择正常的胚胎植入到宫腔内，最终实现减少出生缺陷发生的目的[14-15]。对东南亚缺失型α地贫夫妇进行PGT，在胚胎植入前进行遗传学分析后选择正常胚胎进行移植，可以避免异常胚胎妊娠的发生，可以阻断东南亚缺失型α地贫在家系中的再发风险。PGT把遗传病检测提前到孕前，将遗传病的预防提前到胚胎阶段，与传统的产前诊断相比具有明显的优势，可以避免治疗性引产给母体带来身体和心理的创伤。本研究采用NGS对胚胎――SEA区域直接测序和构建胚胎SNP单体型连锁分析进行PGT，Sanger测序验证――SEA区域NGS结果，对正常和东南亚缺失型α地贫的胚胎进行了低深度的染色体非整倍性筛查。本研究为该东南亚缺失型α地贫夫妇选择正常和发育良好的整倍体胚胎，移植后女方成功妊娠，足月顺产分娩一正常婴儿。

全基因组扩增技术的发明克服了单细胞水平基因检测DNA模板量过少的问题，极大地提高了检测结果的准确性以及单细胞水平基因检测的可靠度，但是WGA会增加扩增不均匀或等位基因脱扣的风险[16]。NGS技术的发明，实现了一次性对上百万条DNA进行测序，不仅缩短了检测时间，也将单碱基测序成本降至最低，使遗传性疾病的诊断率和分辨率迈入新的高度，给PGT技术带来了革命性的改变。NGS技术具有高通量、高并行性和高分辨率等特性，NGS技术可以提供高深度的多位点多基因分析，结合致病基因连锁SNP，可以避免由等位基因漏码(ADO)带来的检测错误[17]。NGS已经成为PGT的主要的检测手段,不但能检测染色体非整倍性、染色体结构异常和单基因遗传病,而且准确性好和精度高[18-19]，与如荧光原位杂交和比较基因组杂交等传统的PGT技术相比具有明显的优势。选择――SEA区域为目标区域，在其上下游2 Mb区域内选择高密度紧密连锁的SNP位点作为遗传连锁标记，多重PCR和NGS后选择106个有效SNP位点构建家系成员SNP单体型，可很大程度上减少因重组或扩增脱扣导致的检测不完全。

本研究采用NGS技术对胚胎――SEA缺失区域直接测序和构建胚胎SNP单体型连锁分析对东南亚缺失型α地贫夫妇进行PGT，避免了重型α地贫胎儿的形成和选择非整倍体胚胎而导致的流产问题，是重型α地贫的有效预防手段。