多重荧光定量PCR法快速鉴定MRSA的临床研究

赵峻英，席家庄，谢铌奇，潘莉娟，王 杉，董 剑

重庆市大足区人民医院检验科，重庆 402360

金黄色葡萄球菌(SA)广泛存在于自然界中，是革兰阳性菌的代表，也是人类的一种重要病原菌，可引起严重的感染性疾病。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是SA中的独特菌株，对所有青霉素和几乎所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，甚至可能对四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类等抗菌药物多重耐药，是引起院内和社区感染的重要病原菌之一，严重威胁人类的健康，成为当今感染医学中的一个难题[1]。因此，高效、灵敏、准确的MRSA检测手段，对于MRSA的早期诊断和精准治疗，以及有效预防和控制MRSA传播至关重要。本研究拟建立单管多通道的Taqman探针荧光定量PCR检测法，直接检测患者标本或临床培养的菌株中的nuc基因及mecA基因，并与传统细菌培养和鉴定方法进行比较，以评估多重荧光定量PCR检测法在快速鉴定MRSA中的应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本及菌株来源 收集2019年1-12月于本院就诊的疑似MRSA感染的患者送检标本共169例，其中痰液55例(32.54%)、尿液10例(5.92%)、脓液43例(25.44%)、分泌物46例(27.22%)、血液5例(2.96%)、灌洗液4例(2.37%)、棉拭子6例(3.55%)。菌株为随机抽取的本院2014年10月至2019年10月保存的SA共156株，均经全自动细菌鉴定仪鉴定，其中MRSA 106株(67.95%)，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)50株(32.05%)。

1.2仪器与试剂 VITEK2 Compact全自动细菌鉴定分析系统及配套细菌鉴定卡、5%CO2恒温培养箱，郑州安图生物工程股份有限公司的哥伦比亚血平板、麦康凯、巧克力及其他平板，英国Oxoid公司的K-B法药敏纸片，SA质控标准菌株(ATCC25923、ATCC29213)购自重庆市临床检验中心。SLAN-96P型实时荧光定量PCR扩增仪购自上海宏石公司，细菌核酸提取试剂盒由重庆中元汇吉生物技术有限公司提供，三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、Champagne Taq DNA多聚酶由北京天根生物科技有限公司生产，PCR引物及Taqman荧光探针由上海捷瑞生物公司合成。

1.3方法

1.3.1常规细菌鉴定及药敏试验 严格按照《全国临床检验操作规程(第4版)》对临床送检的169例标本进行常规细菌培养、鉴定及药敏试验(以下简称为“常规方法”),采用VITEK2 Compact全自动细菌鉴定分析系统及配套细菌鉴定卡。

1.3.2引物及Taqman探针的设计 从NCBI网站获取基因序列，使用Bioedit软件进行序列比对，根据比对结果选择保守区域，使用Primer premier 5.0和Beacon Designer 7.0软件进行PCR引物和Taqman探针设计，探针5′端分别标记Cy5、FAM和VIC，3′端标记MGB，见表1。

1.3.3核酸的提取 (1)临床标本的处理。相对不浓稠的临床标本(尿液、灌洗液、血液、分泌物等)，取1 mL于1.5 mL离心管中；相对浓稠的标本(痰液、脓液等)，先用等体积4%NaOH进行液化后取1 mL于1.5 mL离心管中；棉拭子标本，加入1 mL生理盐水震荡5 min后将液体倒入对应的1.5 mL离心管中；以3 000 r/min离心2 min后，弃900 μL上清液，加入100 μL混匀后的前处理液，盖上离心管盖，涡旋振荡10 s，瞬时离心；90 ℃恒温浴5 min。(2)菌株标本的处理。挑取2～3个菌落或适量菌株标本置于200 μL含细菌前处理液的离心管内；振荡混匀后置于90 ℃恒温浴5 min。进行核酸提取之前每管添加2 μL内控质粒，按照细菌核酸提取试剂盒说明书使用半自动提取仪进行核酸的提取。提取过程设置未加入标本的阴性对照及加入阳性质粒的阳性对照。

1.3.4PCR反应体系及条件 取24 μL DNA反应液、1 μL引物探针混合物于1.5 mL离心管中，震荡混匀后，加入25 μL核酸提取物、阴性对照或阳性对照，总反应体系为50 μL。PCR反应条件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，循环45次；收集并检测荧光。荧光通道检测选用FAM、VIC和Cy5通道。FAM通道对应mecA基因，Cy5通道对应nuc基因，VIC通道对应内标基因。

1.3.5结果判断 VITEK2 Compact全自动细菌鉴定仪GP卡鉴定为SA，若AST-GP67卡头孢西丁筛选试验也呈阳性，即判定为MRSA。多重荧光定量PCR检测结果中，nuc基因和mecA基因阳性则判定为MRSA，nuc基因阳性而mecA基因阴性则判定为MSSA，nuc基因阴性则判定为非SA。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种方法对临床标本的检测结果比较 169例临床标本中，常规方法检出MRSA 48例，检出率为28.40%(48/169)；多重荧光定量PCR检出MRSA 53例，检出率为31.36%(53/169)；两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法检测结果一致的共164例，其中MSSA 64例，MRSA 48例，非SA 52例；两种方法检测结果不一致的为5例，均为PCR基因检测为MRSA，而常规方法未鉴定出MRSA。见表2。

表2 两种方法对169例临床标本的检测结果(n)

2.2两种方法对SA的检测结果比较 156株SA中，常规方法鉴定出MRSA 106株、MSSA 50株，MRSA检出率为67.95%(106/156)。多重荧光定量PCR鉴定出MRSA 108株、MSSA 48株，MRSA检出率为69.23%(108/156)。两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法结果一致的有154例，其中MRSA 106例、MSSA 48例；两种方法结果不一致的有2例，均为多重荧光定量PCR检测为MRSA而常规方法检测为MSSA。见表3。

表3 两种方法对156株SA的鉴定结果(n)

3 讨 论

临床抗菌药物的不合理使用，加速了SA向MRSA的转变。目前，MRSA已经成为引起全球院内感染的重要致病菌之一[2]。因此，研究针对MRSA快速且特异的检测方法势在必行。许多研究证明，MRSA的耐药性主要由mecA基因介导[3-4],其转录产物青霉素结合蛋白2a(PBP2a)使菌株对β-内酰胺酶的结合力明显降低，导致其对β-内酰胺类抗菌药物耐药，故SA一旦获得mecA基因，便可表现为高度和多重耐药，美国临床实验室标准化委员会建议，凡检出mecA基因的SA即可判定为MRSA[5]。nuc基因编码SA的耐热核酸酶，在不同菌株之间有着较高的保守性，是SA的标志性基因。本研究针对SA的特异性基因nuc基因和MRSA的特异性基因mecA基因以及内标基因设计特异性引物和Taqman荧光探针，通过体系优化使三基因能够同时在1个PCR管中进行扩增，通过扩增曲线即可判读实验结果，可同时快速鉴定MRSA或MSSA。

对临床标本的检测中，常规方法和多重荧光定量PCR对MRSA的检出率比较，差异无统计学意义，但仍有5例标本两种方法的检测结果不符合，其中3例为痰液标本，2例为棉拭子标本。将接种这5例临床标本的平板取出仔细观察菌落的生长情况，发现在此3例痰液标本的血平板1区有1～3个溶血菌落生长，而平板的其他区域均为非溶血的其他优势菌落。2例棉拭子标本均为鼻咽拭子，在它们的血平板1区和2区虽有较多溶血菌落生长，但整个平板更多的是其他非溶血菌落的生长。SA是鼻咽部常见的定植菌，临床治疗中更多地是希望从平板培养结果中获取其他致病菌的信息。对于PCR基因检测技术而言，只要标本中存在微量的nuc和mecA基因即可检测出。

对SA的检测中，对于常规方法鉴定出的106株MRSA，多重荧光定量PCR也均检测到nuc基因和mecA基因，二者对MRSA检出率的差异无统计学意义。两种方法检测结果不一致的2株，均为多重荧光定量PCR检测为MRSA，而常规方法鉴定为MSSA。对此2株菌株重新转种培养后分别再次用上述两种方法进行鉴定，结果和之前一样。这2株SA可能是含有mecA基因的隐匿型MRSA菌株，如果以PCR技术作为MRSA鉴定的“金标准”，常规方法MRSA鉴定的正确率为98.15%(106/108)。

多重荧光定量PCR检测具有便捷、快速的优点，不仅可以直接检测临床标本，也可以检测临床分离的菌株，整个过程仅需1～2 h，与常规方法相比时间大大缩短；nuc基因、mecA基因及内控基因3种基因能够同时在1个PCR管中进行扩增，通过扩增曲线可判定MRSA、MSSA和非SA；本研究体系只能检测含mecA基因的MRSA，对与MRSA耐药机制有关的其他基因，如mecC基因[6]，无法检出；能同时检测标本中微量的nuc和mecA基因，可发现隐匿型菌株的存在，减少漏检风险，但无法区分MRSA或MSSA是感染还是定植菌。

虽然MRSA是感染菌还是定植菌需要通过常规细菌培养以及和临床医生沟通后才能判断，对mecA基因以外的其他耐药基因的检测也需后续研究，但本研究建立的多重荧光定量PCR检测法相对于常规方法能更简便、快速、高灵敏、高特异地鉴定临床标本和菌株中的MRSA，提高了MRSA的检出率，减少了漏检风险，对早期院内感染的防控和临床抗菌药物的合理使用具有重要价值。