稽留流产与子宫蜕膜组织中PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA的相关性分析

龚净娴，刘 敏，杨 芳，田春艳，李 蓉

绵阳市中心医院：1.产科；2.妇科，四川绵阳 621000；3.绵阳市第三人民医院妇产科，四川绵阳 621000

稽留流产又称为过期流产或死胎不下[1]，胚胎停止发育后2个月尚未自然排出者为稽留流产。阴道流血及腹痛是稽留流产的常见症状，同时患者可伴有先兆流产症状。先兆流产若不及时处理，不仅影响患者健康，而且可能会影响患者再次生育[2]。为此，早期诊断并采取针对性措施显得尤为重要。目前，关于稽留流产的病因并无定论，可能与生活环境、内分泌水平、精神压力、基因等因素有关[3]。随着分子生物学技术的不断发展，各种分子生物学指标的检测为临床疾病的诊断提供了新的方法。重组人妊娠特异性β1糖蛋白(PSG1)mRNA、重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、Beclin-1 mRNA是近年来研究较多的稽留流产相关指标。有研究报道，稽留流产患者子宫蜕膜组织中PSG1 mRNA、BMP-2水平显著降低，而Beclin-1 mRNA水平显著升高[4]。为此，笔者对比分析了稽留流产患者及健康人工流产者的一般资料及子宫蜕膜组织中PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平，旨在探讨稽留流产的相关因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2019年6月绵阳市中心医院收治的稽留流产患者50例作为观察组，均符合第八版妇产科学稽留流产的诊断标准[5]。另外，选取同期因意外怀孕于绵阳市中心医院行人工流产的健康女性50例作为对照组。排除标准：合并神经系统疾病者；有严重传染性疾病者；长期服用免疫抑制剂者；合并盆腔肿瘤者；有急性上呼吸道感染者；物质滥用者。本研究经该院伦理委员会批准，患者及家属均知情并同意本研究。

1.2方法

1.2.1资料与数据的记录和比较 观察并记录两组患者一般资料[包括性别、年龄、体质量指数(BMI)、卵泡刺激素(FSH)/黄体生成素(LH)、人工流产次数、自然流产次数、不孕时间)、PSG1 mRNA、BMP-2及Beclin-1 mRNA水平]。mRNA水平以相对表达量表示，BMP-2水平以表达分数表示，比较两组间PSG1 mRNA、BMP-2及Beclin-1 mRNA水平差异。

1.2.2mRNA的检测 两组患者均进行人工流产术，术中取子宫蜕膜组织，经磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗血迹后，于-80 ℃冰箱中保存待检。取子宫蜕膜组织20 mg，采用Magzol试剂结合过柱法提取总RNA，检测总RNA纯度、浓度及完整性，用Thermo Scientific RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒，以2 μg RNA作为模版进行反转录，得到cDNA。然后以cDNA为模板，以无RNA酶的DEPC水作阴性对照，待测样品及阴性对照均设3个复孔进行检测。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测蜕膜组织中PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA水平。qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。PSG1上游引物序列为5′-TGCACACAGCGCATCAAA-3′，下游引物序列为5′-CTCCTCTAGTCCCATCATCTCC-3′；Beclin-1上游引物序列为5′-AACCAACGTCTTTAATGCAACCTTC-3′，下游引物序列为5′-AGCAGCATTAATCTCATTCCATTCC-3′；β-actin上游引物序列为5′-GCCGCCAGCTCACCAT-3′，下游引物序列为5′-AATCCTTCTGACCCATGCCC-3′。反应体系为10 μL。应用Bio-Rad qPCR仪进行PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA的检测。PSG1 mRNA qPCR检测的反应条件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共40 个循环；Beclin-1 mRNA qPCR检测的反应条件:94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。记录扩增曲线和熔解曲线，根据扩增曲线，得到每个样本的循环阈值(Ct)值，采用2-ΔΔCt法计算PSG1 mRNA、Beclin-1 mRNA的相对表达量，重复3次检测，取平均值。

1.2.3BMP-2的免疫组化检测 (1)取蜕膜经生理盐水漂洗后置于10%甲醛溶液中固定6～12 h后水洗10～20 min，经梯度酒精脱水后浸蜡、石蜡包埋，5 μm切片;(2)pH 6.0枸橼酸盐缓冲液中加热至95 ℃ 15 min修复抗原，冷却后至3%H2O2溶液中浸泡20 min，平衡盐缓冲液(TBS)洗2次;(3)加一抗37 ℃孵育30 min后置于4 ℃冰箱过夜，TBS缓冲液洗2次;(4)加HRP二抗37 ℃孵育20 min，TBS缓冲液洗2次;(5)DAB显色15 min，自来水冲洗、苏木素复染、冲洗;(6)脱水干燥、透明、封片。BMP-2抗体均为兔多克隆抗体(试剂购自博奥森生物有限公司)。BMP-2表达分数判定标准：应用计算机辅助显微图像分析系统，每次随机抽取5个高倍镜视野进行观察；以细胞内出现黄色颗粒为阳性细胞，无着色为阴性细胞；细胞染色强度从棕黄色、橘黄色、淡黄色染色至无着色依次减弱，分别计3、2、1、0分，同时按阳性细胞百分率计分:>75%计4分，>50%～75%计3分，>25%～50%计2分，5%～25%计1分，<5%计0分，染色分数和阳性细胞百分率计分相乘得到表达分数。

2 结 果

2.1两组间PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平比较 观察组PSG1 mRNA、BMP-2水平低于对照组(P<0.05)，Beclin-1 mRNA水平高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组间PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平的比较

2.2稽留流产单因素分析 年龄、BMI、FSH/LH、人工流产次数、自然流产次数、不孕时间、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平与稽留流产具有相关性(P<0.05)，见表2。

表2 稽留流产的单因素分析[n(%),n=50]

2.3稽留流产的多因素Logistic回归分析 经Logistic回归分析，人工流产次数、自然流产次数、不孕时间、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平与稽留流产具有相关性(P<0.05)，见表3。

表3 稽留流产的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

稽留流产不仅危害母体健康，而且死胎长期留在体内可能会影响下次妊娠及胚胎着床。为此，及时识别稽留流产并采取相应干预措施在稽留流产的防治中显得尤为重要[6]。稽留流产的发生过程：早期妊娠囊胚着床后，绒毛滋养细胞侵入母体螺旋动脉，形成“滋养细胞栓”，闭合了螺旋动脉，限制母血流入，导致胎盘在低氧状态中发育，最终导致流产。由于低氧状态会提高滋养细胞的应激水平，介导细胞自噬的产生，子宫蜕膜组织中的胚胎相关因子水平也会受到显著影响。

PSG1是孕期母体中发现的主要胎盘蛋白，胎盘合胞体滋养层是PSG1的主要来源。PSG1具有一定的免疫功能，能通过调节巨噬细胞的表达来增强胚胎的免疫功能。有研究发现，在胎儿缺血、缺氧等应激状态时，PSG1的水平有明显波动[7]。在保护胎儿的同时，PSG1对母体也有一定的免疫增强功能。骨形成蛋白(BMP)是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于转化生长因子-β家族。BMP-2能刺激DNA的合成和复制，从而促进间充质细胞定向分化为成骨细胞。它还是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。在胚胎发育的早期，BMP-2表达水平较为稳定，当出现胎儿宫内窘迫时BMP-2水平受到显著影响，呈下降趋势[8]。有研究发现，稽留流产患者胎盘细胞自噬功能显著增强，可能与胎盘细胞的自我保护有关，而其中自噬相关蛋白Beclin-1在这个过程中发挥着重要的作用[9-10]。

本研究中，观察组患者PSG1 mRNA、BMP-2水平均低于对照组，观察组Beclin-1 mRNA水平高于对照组，可能与稽留流产患者胎盘系统应激反应及自噬的激活有关[10-11]。单因素分析和多因素Logistic回归分析显示，人工流产次数、自然流产次数、不孕时间、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平与稽留流产具有一定的相关性。有研究发现，首次流产患者子宫蜕膜组织PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平与再次妊娠时子宫蜕膜组织上述指标的水平具有一定的相关性[12-14]，这意味着若首次妊娠时上述指标的水平异常则下次妊娠时这些指标水平异常风险会增加，这对于想再次妊娠的患者具有一定的意义。

综上所述，人工流产次数、自然流产次数、不孕时间、PSG1 mRNA、BMP-2、Beclin-1 mRNA水平与稽留流产具有一定的相关性，可为稽留流产的诊断提供参考。