大麻二酚对阿霉素心肌毒性的保护作用及机制研究

俞东霞, 吴玉宇

(浙江省青春医院 心电图室，浙江 杭州 310020)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前临床最常用的广谱抗肿瘤药物之一，但其剂量依赖性的心脏毒性副作用限制了临床应用。阿霉素心脏毒性还可发展至不可逆的心肌病及心力衰竭[1]。阿霉素心脏毒性的具体机制尚未阐明，可能与氧化/硝化应激反应、细胞凋亡机制激活、线粒体功能障碍、继发炎症反应等相关[2]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是从大麻中提取的非精神类药物，体内不激活1型和2型大麻素受体，人体应用安全。研究[2]发现，在结肠炎、缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、糖尿病及其并发症等疾病模型中，大麻二酚具有抗氧化和抗炎作用。在国外，含大麻二酚的药物已被临床应用于治疗小儿癫痫、多发性硬化所致的疼痛和痉挛[3]。本研究利用小鼠阿霉素心脏毒性模型，在氧化/硝化应激反应、凋亡信号通路等方面探讨大麻二酚对阿霉素心脏毒性的保护作用及其机制，以期为阿霉素心脏毒性的防治研究提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 C57BL/6小鼠购自浙江省医学科学院实验动物中心， 6～8周龄，雄性，体质量22～30 g。阿霉素购自Med Chem Express公司，大麻二酚购自Tocris公司，血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，抗NAPDH氧化酶(NOX2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、GAPDH抗体购自Santa Cruz公司，超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司，逆转录试剂盒购自Roche公司。

1.2 小鼠心肌毒性模型构建 小鼠心肌毒性模型构建[4]：C57BL/6小鼠腹腔单次注射阿霉素(20 mg/kg)，自由进食进水，5 d后麻醉下处死动物获取所需标本。

1.3 实验动物分组及给药 40只C57BL/6小鼠随机分成4组，每组10只：⑴阿霉素致心脏毒性组(DOX组)：腹腔单次注射阿霉素(20 mg/kg)；⑵CBD干预组(DOX+CBD组)： 腹腔单次注射阿霉素(20 mg/kg)，在注射阿霉素前90 min腹腔注射大麻二酚(10 mg/kg)，次日开始每天腹腔注射大麻二酚(10 mg/kg)1次，注射5 d；⑶大麻二酚对照组(CBD组)：腹腔仅注射大麻二酚，剂量、疗程按照DOX+CBD组中CBD使用；⑷阴性对照组(Control组)：仅腹腔注射等量的生理盐水。药物干预5 d后麻醉处死小鼠，获取所需标本进行相应的检测。

1.4 CK和LDH测定 小鼠处死后留取血液标本，静置30 min后，3 500 r/min(有效离心半径8.5 cm)离心5 min后取血清。按照CK和LDH测定试剂盒说明书方法检测CK和LDH水平。

1.5 心肌组织NOX2、iNOS蛋白印迹测定 取小鼠部分心肌组织加RIPA裂解液在冰上裂解并提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取100 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶封闭后，分别加入抗NOX2、iNOS、GAPDH一抗(一抗1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST洗脱后加二抗(二抗1∶2 500稀释)，孵育1 h，ECL化学显色发光。

1.6 心肌组织SOD、GSH、MDA水平测定 取小鼠部分心肌组织液氮保存，预冷PBS中匀浆。按照SOD、GSH、MDA检测试剂盒说明书方法测定心肌组织中SOD、GSH、MDA水平。

1.7 实时荧光定量PCR 取小鼠部分心肌组织研磨，Trizol法提取RNA，逆转录为cDNA。构建PCR反应体系，利用Primer-BLAST设计引物，以GAPDH作为内参，采用相对2-△△CT法进行定量分析。引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.8 统计学分析 计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大麻二酚对小鼠CK和LDH水平的影响 DOX组小鼠的血清CK和LDH水平高于阴性对照组和CBD组，CBD+DOX组的CK和LDH水平均低于DOX组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 大麻二酚对小鼠氧化应激损伤的影响 DOX组的NOX2、iNOS表达均高于阴性对照组和CBD组，CBD+DOX组的NOX2、iNOS表达均低于DOX组，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2A，图2B，图2C)；DOX组的MDA水平高于阴性对照组和CBD组(图2D)，SOD、GSH水平均低于阴性对照组和CBD组(图2E，图2F)；CBD+DOX组的MDA水平低于DOX组，CBD+DOX组的SOD、GSH水平均高于DOX组；差异均有统计学意义(P<0.05)。

*与Control、CBD组比较，P<0.05；#与DOX组比较，P<0.05。图2 大麻二酚对小鼠氧化应激损伤的影响

2.3 大麻二酚对小鼠心肌组织凋亡通路的影响 DOX组小鼠心肌组织的Caspase 3 mRNA、Caspase 8 mRNA、Caspase 9 mRNA水平均高于阴性对照组和CBD组，CBD+DOX组的Caspase 3 mRNA、Caspase 8 mRNA、Caspase 9 mRNA水平均低于DOX组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

*与Control、CBD组比较，P<0.05；#与DOX组比较，P<0.05。图3 大麻二酚对小鼠心肌组织凋亡通路的影响

2.4 大麻二酚对小鼠TNF-α、IL-1β mRNA水平的影响 DOX组小鼠心肌组织的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA水平均高于阴性对照组和CBD组，CBD+DOX组的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA水平均低于DOX组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨论

阿霉素引起的心肌病是一个复杂的过程，具体机制目前尚不明确，除营养支持外无有效治疗措施。

*与Control、CBD组比较，P<0.05；#与DOX组比较，P<0.05。图4 大麻二酚对小鼠TNF-α、IL-1β mRNA水平的影响

大麻二酚从大麻中提取，在多种炎性疾病或神经退行性病变模型中被证实具有潜在的抗氧化抗炎作用，且上述作用与经典的G蛋白偶联受体CB1、CB2无关[5]。

研究[6]发现，腹腔注射阿霉素能显著提高心肌组织中氧化/硝化应激反应，同时损害体内抗氧化保护机制。NADPH氧化酶(尤其是NOX2)依赖性的氧自由基(ROS)在阿霉素心脏损伤中起重要作用。本研究结果显示，阿霉素腹腔注射不仅能显著提高小鼠心肌组织中NOX2水平，同时也增加了iNOS表达，因iNOS产生的NO和超氧阴离子参与过氧亚硝酸盐的形成，提示iNOS参与了阿霉素致心肌损伤过程。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine, 3-NT)是过氧亚硝酸盐形成的标志，广义上代表了硝化应激的水平。过氧亚硝酸盐可导致脂质过氧化，MDA是脂质过氧化的终产物之一，是ROS产生的标志。关键收缩蛋白、内质网Ca2+通道的硝基化触发促分裂素原活化蛋白激酶(MARP)的激活，后者活化细胞凋亡通路、影响线粒体功能。上述因素又反过来促使更多活性氧自由基产生，恶性循环不断加重，最终导致心肌损伤、心脏功能障碍。阿霉素诱导小鼠心肌中NOX2、iNOS表达增高，ROS产生增多，同时损害了体内抗氧化保护机制(减低了GSH和SOD水平)，导致组织氧化/应激损伤，3-NT和MDA升高，最终影响组织器官功能。本研究结果显示，CBD能下调NADPH氧化酶(NOX2)表达，减少DOX诱导的心肌组织ROS产生；CBD降低DOX诱导的iNOS表达升高，减少了产生过氧化亚硝酸盐所需的NO；同时CBD通过增加体内氧自由基的清除(增加了GSH和SOD水平)，来缓解DOX引起的小鼠心肌组织中氧化应激损伤(降低了MDA水平)。研究[7]认为，阻断NADPH氧化酶和iNOS通路在多个模型中起重要作用，如顺铂肾损伤、脏器缺血再灌注损伤等。本研究结果提示上述通路在阿霉素心肌损伤中起重要作用，阻断上述通路可能减轻其心脏毒性。

阿霉素引起心肌组织中凋亡通路的活化(Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表达升高)，炎症反应(TNF-α，IL-1β表达增高)，促进心肌组织损伤。研究[8-9]报道，在糖尿病心肌病、心肌梗死动物模型中，CBD都有降低炎症反应的作用，而且在大麻素受体2敲除小鼠中，CBD亦有抗氧化应激和抗炎作用，这更证实了CBD并不通过大麻素受体发挥作用。本研究结果显示，CBD可明显减低DOX诱导的炎症因子表达增加，降低相关炎症反应；另一方面，CBD减轻DOX诱导的心肌组织中凋亡通路的激活，减轻心肌组织损伤。

CBD能减轻DOX心肌毒性作用，但CBD是否影响DOX的抗肿瘤效应目前尚未完全明了。CBD对多个肿瘤细胞系都具有抗肿瘤活性；CBD可抑制基质金属蛋白酶活性，而基质金属蛋白酶在肿瘤进展和转移中起重要作用，提示CBD对抗肿瘤药物可能是起协同而非拮抗作用[10]，后续还需进一步验证。

综上所述，CBD可能通过缓解氧化/硝化应激反应、减轻炎症反应，下调凋亡通路激活等机制缓解小鼠DOX心脏毒性作用。