miRNA-29c在前列腺癌中的表达及其临床意义

蔡海荣，王 平，金百冶

(1.浙江大学 医学院，浙江 杭州 310002；2.浙江台州市立医院 泌尿外科，浙江 台州 318000；3.浙江大学医学院附属第一医院 泌尿外科，浙江 杭州 310006)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。据美国最新2019年研究调查数据显示，前列腺癌在美国十大癌症新发病率中上升至第1位，其所致死亡数高居美国男性癌症相关死亡第二位[1]；同样，前列腺癌在我国的发病率亦呈逐年上升趋势。目前临床主要是通过检测前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)表达水平来进行筛查和早期诊断，然而PSA作为前列腺癌早期诊断的标志物缺乏敏感性和特异性。因此，积极寻找新的诊断标志物来联合PSA作为前列腺癌早期诊断标记，是当前研究的热点[2]。

MicroRNA(miRNA)是一类调节蛋白编码的内源性小分子单链RNA,其主要通过与信使RNA的特定序列结合，从而抑制翻译或剪切RNA转录物来对基因进行转录后表达的调控[3]。miRNA-29c在许多实体肿瘤如神经胶质瘤、肝细胞癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌中均呈低表达，并且起到抑癌基因作用。然而，miRNA-29c在前列腺癌中的作用和潜在机制尚不明确。本文通过检测miRNA-29c在前列腺癌患者中的表达量，探讨其在前列腺癌中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象选择 选取本院泌尿外科2015年1月—2017年1月收治的40例前列腺癌患者，纳入标准：①经病理切片证实；②首次诊断。排除标准：①他处具有原发性肿瘤；②术前具有放化疗治疗；③不配合实验者。患者年龄48～82岁，平均(64.5±9.8)岁，其中年龄≥60岁26例，<60岁14例。将肿瘤按2016AJCC TNM分期进行分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；将前列腺癌按病理Gleason评分分级：高分化腺癌26例(Gleason2～6分)，中分化腺癌8例(Gleason7分)，低分化腺癌6例(Gleason8～10分)。同期选取前列腺增生(BPH)患者30例，平均年龄(61.9±8.44)岁；健康体检男性30例，平均(42.13±9.22)岁。所有患者疾病确诊前后均未进行任何治疗。

1.2 主要试剂和仪器 RNA 抽提试剂Trizol 购自Invitrogen 公司，逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq 试剂盒均购自TaKaRa 公司，miRNA-29c、U6逆转录引物和PCR上下游引物均由广州Ribobio生物科技有限公司提供。实时荧光定量 PCR仪器购自美国Bio-Rad有限公司。

1.3 标本收集和处理 收集40例前列腺癌患者血清及其癌和癌旁组织、30例前列腺增生患者血清及30例健康体检男性血清。前列腺癌患者新鲜静脉血2 mL，以2 000 r/min在离心机上离心10 min，吸取其上清液移至2 mL离心管中，再以12 000 r/min离心2 min，吸取上层无细胞血清200 μL至2 mL EP中，放置-80℃冰箱中保存待测。用TRIzol试剂盒，根据操作说明提取各血清样本中的总RNA，并测定总RNA浓度及纯度，取吸光度比值为1.8～2.1的样品用于后续试验。前列腺癌及癌旁组织标本直接放入液氮中保存备用；同样使用TRIzol试剂盒提取癌及癌旁组织标本的总RNA。取 400 ng总RNA，TaKaRa逆转录反应试剂盒酶进行逆转录反应，反应体系为10 μL，包括 5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μM)0.5 μL，Random 6 mers(100 μM)0.5 μL，补无酶水至10 μL。 反应条件为37℃ 15 min(反转录反应)，85℃ 5 s(反转录酶的失活反应)，4℃，产物置于-20℃冰箱保存备用。

1.4 miRNA-29c的表达水平测定 根据TRIzol试剂盒操作说明提取各样本的总RNA，并测定总RNA浓度；然后依据逆转录试剂盒操作说明，以U6作为内参，将样本分别逆转录成为cDNA；再以U6作为内参，SYBR© Premix Ex Taq II聚合酶、miRNA-29c引物和 SYBRGreen荧光染料进行实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)，miRNA-29c引物序列：上游序列5′-UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC-3′,下游序列5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3′，其中以 U6 作为内参引物， 其上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相对表达量计算公式为 RQ=2-△△CT。

1.5 统计学处理 应用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行整理及分析，计量资料2组间比较用t检验，多组间比较采用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-29c的表达水平 前列腺癌患者、BPH者和健康体检者血清中miRNA-29c的表达量分别为(0.357±0.012)、(0.836±0.023)和(0.818±0.015)。前列腺癌患者血清中miRNA-29c的表达水平显著低于BPH和健康体检者，差异均有统计学意义(P<0.001)；BPH组和健康对照组血清中的miRNA-29c表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

***：P<0.001图1 miRNA-29c在前列腺癌(PCA)、良性前列腺增生(BPH)和健康对照(NC)血清中的相对表达量

2.2 血清miRNA-29c表达变化与PC患者临床病理相关参数的相关性 对前列腺癌患者临床病理相关参数进行分组(表1)，结果提示：不同Gleason评分、肿瘤分期及是否骨转移的患者间血清miRNA-29c表达水平差异有统计学意义(P<0.001)，不同血清前列腺抗原(PSA)水平的患者间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同临床病理参数前列腺癌患者的血清miRNA-29c表达水平比较

2.3 前列腺癌患者癌组织中的miRNA-29c表达水平 RT-PCR检测结果显示，miRNA-29c在40例前列腺癌实体肿瘤组织及其癌旁组织中的表达水平分别为(0.86±0.038)、(1.38±0.072)，2者间差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 miRNA-29c在前列腺癌及其癌旁组织中的表达水平

3 讨论

迄今为止，前列腺癌的发病机制仍然没有明确，早期前列腺癌患者接受及时有效的治疗后，大部分能得到比较好的恢复，但由于前列腺癌早期无明显的临床特征，出现症状时，往往已经处于晚期。临床上对前列腺癌早期筛查主要是通过检测前列腺特异性抗原(PSA)，且PSA是前列腺癌诊断及预后的常用指标，诊断前列腺癌的PSA标准临界值为4 ng/L，然而当PSA值为4～10 ng/mL时(即PSA灰区)，前列腺癌的检出率不超过30%[4]，同时PSA又容易导致对前列腺癌的诊断和治疗过度[5]；此外PSA在前列腺增生及前列腺炎患者中有时同样会出现一定程度的升高，这就使其在临床上的应用产生局限性。

miRNA是一种内源性非编码RNA，主要通过特异性结合靶基因mRNA的3′-UTR序列，从而起到调控目的基因的表达及翻译作用，miRNA参与机体内60%以上的基因调控网络[6]。作为转录后调控序列，miRNA参与机体的各种生理功能，在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用[7-9]。某些miRNA 表达与多种恶性肿瘤相关，起着抑癌基因及癌基因的作用，有些甚至与恶性肿瘤的诊断预后相关[10-11]。miRNA-29家族包括miR-29a/b/c, miRNA-29c位于第1号染色体，是此家族主要成员，miRNA-29a/b/c只是2个或者3个碱基不同，miRNA-29a和miRNA-29c主要通过RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex RISC)机制发挥作用，miRNA-29b主要通过其他机制调节靶基因的表达[12]。该家族成员在恶性肿瘤细胞的表达都出现异常且执行抗肿瘤的作用，其成员在功能上具有重叠的地方，如转录调控、细胞凋亡、表观遗传修饰等[13]。虽然成熟的miR-29a/b/c序列高度相同，然而miRNA-29家族中不同亚型各自发挥其独特的功能[14]。miRNA-29c在许多实体肿瘤如乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、膀胱癌等中均呈低表达，并且起到抑癌基因作用[15-17]。如在三阴性乳腺癌癌前病变中，miRNA-29c及其下游通路起到重要调节作用[18]；在胃癌中，miRNA-29c可以通过和RCC2靶向结合，降低其表达，从而起到抑制胃癌增殖的能力[19]；在膀胱癌中，miRNA-29c通过调控靶基因CDK6起到抑制其增殖与侵袭的作用[20]；此外，Zhang等[21]研究发现在结直肠癌中miRNA-29c呈低表达，SPARC被确定为miRNA-29c的直接靶标，其沉默可降低肠癌细胞增殖和迁移。最近研究发现miRNA-29c通过多途径对前列腺癌的发展起抑制作用，如Li等[22]研究发现上调的miRNA-29c通过抑制前列腺癌中的SLC2A3基因表达来抑制其细胞增殖和糖酵解。

在本研究中，我们发现miRNA-29c在前列腺癌患者血清中的表达量显著低于BPH患者和健康对照者，而BPH患者和健康对照者间无显著性差异。进一步分析发现Gleason评分≥7分、Ⅲ/Ⅳ期、有骨转移的前列腺癌患者的miRNA-29c表达量明显低于<7分、Ⅰ/Ⅱ期、无骨转移的患者，可见miRNA-29c的表达水平随着临床分期的增加而进一步下降，而与血清前列腺抗原(PSA)水平无明显相关。因此，可以通过检测血清miRNA-29c的表达水平来区分前列腺癌患者与健康者，为临床上对前列腺癌患者的早期诊断提供可靠依据。此外，miRNA-29c在Gleason评分及临床分期越高的前列腺癌患者中表达越低，Gleason评分代表前列腺癌的肿瘤分化程度，积分为2、3、4分者属于高分化腺癌；5、6、7分者属于中分化腺癌；8、9、10分者属于低或者未分化癌，据此可推测miRNA-29c可能参与了前列腺癌的发生、发展过程及侵袭转移过程。

综上所述，目前对于前列腺癌的早期诊断，缺乏灵敏度和特异度较高的诊断标志物，需要寻找具有较高灵敏度及特异度的诊断标志物来进一步提高前列腺癌患者的诊断率。本研究结果提示miRNA-29c在前列腺癌组织及血清中低表达，且miRNA-29c的表达与前列腺癌临床分期、病理学分级和远处转移等具有相关性，低表达的 miRNA-29c可能参与了前列腺癌的发生、发展过程，对其检测在前列腺癌患者的早期诊断及预后判断中具有一定价值。