物理方法在骨髓间充质干细胞生物学特性中的研究进展

倪金波，尹 航，姜建勇

(1.浙江中医药大学 第二临床医学院，浙江 杭州 310053；2.温州医科大学附属萧山医院 骨科，浙江 杭州 311201)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是最早被发现的间充质干细胞，主要存在于骨髓组织，具有自我增殖和更新的能力。BMSCs在移植技术领域的发展为再生医学等学科做出了重要贡献[1]。适当的物理因素，如：力学、电磁场、温度、激光、超声等在 BMSCs 成骨分化过程中发挥着不可忽视的作用[2]。本文综述近年来物理方法在BMSCs生物学特性中的相关研究进展，为指导BMSCs在再生医学和组织工程领域的应用提供新思路。

1 BMSCs生物学特性

1.1 生长特性 BMSCs一般呈纺锤型，少量呈圆形、椭圆形、星型、多角型等，在形态学上与成纤维细胞类似。研究[3]表明，BMSCs具有贴壁性，一开始生长缓慢，之后进入指数增长期，最后到达平台期。BMSCs的生长曲线呈“S”型。一般认为，间充质干细胞有分化成多种细胞的能力。骨髓间充质干细胞成骨分化能力较强[4]，被认为是骨组织损伤与修复的有效材料之一。研究发现，BMSCs和脂肪干细胞(ADSCs) 的增殖和分化能力随着传代次数的增加而下降[5-6]。Jiang等[7]研究发现，BMSCs治疗骨缺损的能力随着传代次数的增加而减弱，其原因可能与端粒酶的活性和染色体的异质性有关；BMSCs临床应用为3～5代。

1.2 表面分子标记 人BMSCs的群体表达包括CD44、CD105、CD106、CD73和Sca-1，而在细胞生长发育过程中极少表达CD11a、CD45、CD235a、HLA-DR等表面标记物[8-10]。邹维艳等[4]研究发现，SD大鼠BMSCs低表达CD45，BALB/c大鼠BMSCs高表达CD45。当BALB/c大鼠传代培养至20多代后，CD45的表达也明显下降。

2 力学因素的影响作用

有文献[11]显示，运动组成纤维集落形成单位(CFU-F)的集落数显著高于久坐组，提示运动能够显著增加BMSCs与ADSCs的增殖能力。张丽等[3]进一步阐述了剪切力、应压力、牵张力、微重力和离心力等力学因素在骨髓间充质干细胞诱导骨分化的过程中所扮演的角色。随着研究的深入，科学家发现机械刺激可导致多种信号通路的激活，如整合素、离子通道、NO和前列腺素E2等，这些信号转导通路会激活下游信号介质并激活成骨分化相关的转录因子，影响BMSCs的增殖分化。

2.1 剪切力 剪切力是细胞周围流动的液体对细胞表面产生单位面积的力。在体外模拟过程中，研究人员发现不同的流体剪切力会影响BMSCs的成骨分化。Liu等[12]认为间歇性的流体剪切力比连续性的流体剪切力更能促进细胞的成骨分化，ERK1/2在该过程中具有关键作用。但另有研究[13]表明，流体剪切力会损伤BMSCs的存活和分化。流体剪切力的强度在BMSCs分化过程中具有重要作用。

2.2 应压力 静水压是椎间盘在人直立、弯腰和行走等日常活动中的主要受力形式。研究[14]发现，流体静水压能显著增加骨髓间充质干细胞增殖分化的效率。Cheng等[15]通过同位素氨基酸标记法(SILAC)检测BMSCs在机械刺激后的差异表达，结果显示，在静水压力刺激下，BMSCs中经典的膜机械受体整合素β1增加；炭疽毒素蛋白受体(ANTXR1)特异性激活Smad2，并上调Smad4的表达，活化的Smad2转运到细胞核调节软骨形成。还有相关研究显示，雌激素受体[16]、细胞骨架调节蛋白RAS[17]等都参与相关信号转导。

2.3 牵张力 人体运动过程中会受到肌肉收缩与舒张产生的拉力，即牵张力。研究[18-19]发现，牵张力是激活和促进骨髓间充质干细胞分化的一个重要因素。目前，研究更多的是牵张力刺激的频率、时间、大小和影响BMSCs的机制。有研究[18]提出：12%的牵张力和600 με、0.25 Hz的拉伸应变有利于促进细胞纺锤体形状的稳定。Nam等[20]采用不同速率和应变的机械单轴拉伸体外培养发现，当施加4%的应变+1 Hz时，细胞的增殖速度最快，而在8%应变+1 Hz负载下，胶原蛋白的产生和张力基因表达最高。

2.4 微重力 又称“零重力”，微重力环境对人体的骨骼肌肉有一定的影响，也同样影响着BMSCs的增殖和分化。微重力的效应模拟设施有很多，其中后肢/尾悬吊微重力活体动物实验模型为比较理想的模型[21]。在实验模拟下，研究发现微重力抑制BMSCs细胞学形态的稳定。Dai等[22]观察模拟微重力下BMSCs的群体生长，并用CD34、CD44和CD106进行标记分析发现，细胞周期停滞于G0/G1期，且生长因子等促进BMSCs增殖的细胞因子的影响力弱于重力下的刺激。有研究[23]报道，其相关机制可能与RhoA蛋白活性变化，影响细胞骨架与黏附性有关，进而影响细胞的增殖与成骨分化。在微重力的作用下，Coll2、ANCN和Coll10等软骨相关因子高度表达，提示微重力作用有利于BMSCs分化为软骨细胞并维持其稳定[24-25]。还有研究[26]发现，回转器模拟微重力(SMG)显著抑制了具有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)的表达，TAZ是骨形成的重要调节因子。另有研究[27]表明，在微重力作用下，骨髓间充质干细胞通过细胞骨架的改变和多电位标记OCT4的上调改变了分化的潜能；在短时间微重力的影响下，骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞、脂肪细胞和神经元样细胞分化的能力。随着组织工程的不断深入，利用空间基地对BMSCs的研究也取得新的突破。

2.5 离心力 蒋斌等[28]通过模拟装置体外研究发现，低转速的离心力促进BMSCs的增殖，而高转速则起到抑制作用，其中最适宜的离心力速度为500 r(12 cm)/min。李晓亮等[29]的实验探讨了不同分化周期对低转速下BMSCs增殖和分化能力的影响，结果显示，离心力能显著促进BMSCs的增殖与骨化。

3 电磁场的影响作用

张敏等[30]研究显示，脉冲电磁场(pulsed electromagnetic field, PEMF)能显著增加BMSCs的增殖能力并保持其长梭形态，15 Hz频率、1 mT磁感应强度条件能显著促进BMSCs增殖和碱性磷酸酶活性。Ongaro等[31]进一步研究发现，PEMF的成骨作用与碱性磷酸酶活性、骨钙素水平和基质矿化等早期或晚期的成骨生物活性因子相关。

有研究发现，Wnt/β-Catenin信号通路[32]，PKA和ERK1/2通路[33]在PEMF诱导BMSCs成骨分化的过程中起着重要作用，磁场激活了cAMP和MAPK等信号通路。然而有关电磁场促进骨分化还有争议，相关机制还需进一步研究阐明。

4 超声波的影响作用

早期研究[34]发现，低强度的超声脉冲能显著增高兔骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素的含量，这为超声波在骨组织工程的运用和为解决骨折愈合的临床治疗提供了新思路。He等[35]的研究显示，低强度脉冲超声在诱导剂的作用下能加速BMSCs的早期成骨和血管的生成。进一步的研究[36]发现，超声波的信号转导与细胞间的缝隙连接有关，同时缝隙连接有助于超声波对骨髓间充质干细胞的刺激作用，这种刺激作用可能与激活ERK1/2和/或P38通路有关。另一项研究[37]发现，经转化生长因子-β1处理的骨髓基质细胞通过整合素-mTOR信号通路能显著促进软骨形成，为治疗关节软骨损伤与老化带来了不同思路。然而超声波能否诱导分化BMSCs成更多不同类型的细胞、组织，并拓展临床治疗手段，需进一步探索。

5 温度的影响作用

有研究[38]显示，稳定的温度控制能缩短细胞的培养时间和提高细胞的质量。也有研究[39]提出，较高的温度反而比37℃下更有利于BMSCs的复苏和分化。可见在BMSCs的增殖和分化过程中，温度扮演着重要的角色。Ren等[40]研究发现，低温能够抑制BMSCs的增殖和分化，却增加了BMSCs分化为神经细胞的比例，其机制可能与小泛素类修饰物(SUMO)的基化有关。SUMO提高BMSCs在低温下的耐受性，以此增强SUMO和BMSCs靶蛋白的结合能力。

6 激光的影响作用

有研究[41-42]显示，激光疗法能影响BMSCs的生物学特性，促进其增殖和分泌。Wang等[43]研究不同能量强度的低强度激光对BMSCs的影响，结果显示，2 J/cm2和4 J/cm2的密度能显著促进健康和炎症下BMSCs的增殖和成骨分化，但当强度到达16 J/cm2时，反而抑制BMSCs的生长发育，表明在创伤早期、局部炎症情况下，低强度激光照射能促进BMSCs对于骨组织缺损的修复。另有研究[44]表明，绿色激光照射能增强成骨细胞的分化，绿色激光治疗的主要优点是减少出血和疼痛。绿光的适宜强度是4 J/cm2，与之前的研究结论相似，有关激光强度的研究还有待进一步深入。

7 展望

骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞和肝细胞等[45]。故BMSCs在生物医学、组织工程等领域为各种疾病提供新的临床思路，带来新的临床疗法，解决实际的临床问题。随着研究的深入，不同的物理刺激诱导BMSCs定向分化的研究已取得重要的进展，但各个物理刺激信号转导机制、不同物理刺激促分化强度的量化、最佳物理刺激条件寻找等问题尚需进一步的探索。