SPC25在胶质瘤患者中的表达及其对胶质瘤细胞增殖的作用

汪德秀，王 丰，徐 强，孙孟坊

(浙江中医药大学附属温州中西医结合医院 神经外科，浙江 温州 325008)

胶质瘤是中枢神经系统常见的原发性恶性肿瘤疾病，常规手术、放化疗治疗效果均不十分理想，其中位生存期不足15个月[1]。胶质瘤的发生发展是一个多种致癌基因共同作用的结果，癌基因的筛查和分析有助于更好地认识胶质瘤，为胶质瘤治疗提供新靶点[2-4]。纺锤体极成分25(spindle pole body component 25，SPC25) ，又名着丝粒复合物成分(NDC80 kinetochore complex component)[5-6]，被认为参与着丝粒微管的相互作用和纺锤体检查点活性的调控，在肺癌、前列腺癌等肿瘤中均具有促癌作用，但其在胶质瘤中尚无研究报道。本研究观察SPC25在胶质瘤患者中的表达和对胶质瘤细胞增殖的影响，以期为胶质瘤治疗的新靶点筛选提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年1月—2014年12月温州市中西医结合医院收治的不同级别胶质瘤患者90例，其中男55例，女35例，年龄40～65岁，平均年龄(52.9±6.5)岁。根据WHO病理分级标准[2]，Ⅱ级20例，Ⅲ级32例，Ⅳ级38例。收集同期10例脑外伤患者作为对照组，男6例，女4例，年龄40～65岁，平均年龄(53.7±6.8)岁。2组患者年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)。所选胶质瘤患者均经术后病理诊断确诊，患者均不存在已明确的与SPC25表达相关的其它疾病。本研究经医院伦理委员会批准，所选患者均签署知情同意书。

1.2 材料 人脑胶质瘤细胞系U87购自美国ATCC细胞库，胎牛血清FBS，DMEM，PBS，0.25%含EDTA的胰酶，1%青链霉素均购自Gbico生物科技有限公司。人全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白上样缓冲液、ECL发光液等Western blot相关试剂均购自碧云天生物科技有限公司。免疫组化试剂盒购自福建迈新生物科技有限公司，SPC25抗体、β-actin及HRP标记的山羊抗兔抗体购自CST生物科技有限公司，RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒及qPCR试剂均购自北京全式金生物科技有限公司。SPC25-siRNA由上海生工生物科技有限公司设计并合成，转染试剂lipo3000购自Life invritogen有限公司，MTS试剂盒及结晶紫染色液购自北京索莱宝凯基生物科技有限公司。

1.3 生物信息学分析 基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库进行生物信息学分析和统计(https://cancergenome.nih.gov)，采用GlioVis(http://gliovis.bioinfo.cnio.es)数据平台获取TCGA数据库中胶质瘤患者SPC25的表达水平、预后生存时间等临床资料数据，并进行相关统计学分析。

1.4 Western blot 将胶质瘤组织和正常脑组织进行充分研磨、匀浆，或收集生长状态良好的细胞，采用全蛋白提取试剂盒提取组织中的全蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。配制上样缓冲液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜湿转，5%奶粉封闭，采用TBST以1∶1 000比例稀释anti-SPC25、anti-β-actin，4℃孵育过夜(大于12 h)，次日孵育HRP标记的二抗，ECL曝光检测SPC25的表达情况。

1.5 荧光定量PCR 组织RNA提取：取胶质瘤组织充分研磨后，加入1 mL Trizol反复吹打、充分混匀后转移至无RNA酶的1.5 mL EP 管中，室温下静置10 min。随后加入200 μL氯仿，室温下剧烈震荡5 min，4℃ 12 000 g离心10 min。将上清液转移至新的EP管中，加入500 μL异丙醇，上下颠倒混匀后室温静置10 min。4℃ 12 000g 离心10 min，弃上清，向底部沉淀加入1 mL 75% 乙醇吹打洗脱，4℃ 7 500 g离心5 min，弃上清。沉淀室温下干燥10 min后加入40 μL DEPC水溶解，即为RNA样品，冻存于-80℃中。细胞RNA提取：选取生长状态良好的细胞接种至6孔板中，待细胞生长至汇合度85%时，用预冷的PBS清洗贴壁的细胞3次，每孔加入1 mL Trizol充分溶解细胞，后续实验步骤同组织RNA提取。随后采用反转录试剂盒构建cDNA，采用荧光定量PCR检测各组织SPC25的表达水平。随后采用反转录试剂盒构建cDNA，采用荧光定量PCR检测各组织SPC25的表达水平。引物：SPC25:F: 5'- TTTGGTAACAGCGACACGG -3', R: 5'- CGGAGCCAGCAAGGTTT -3'；GAPDH: 5'- TGATAATGAATGTGTAAAAT -3', R: 5'-CCTCTGCCTCCCGGGTTCACAG-3'。

1.6 免疫组化 将胶质瘤组织和正常脑组织立即给予4%的多聚甲醛固定48 h，酒精梯度脱水，二甲苯通透，石蜡包埋。采用4 μm厚度切片，酒精梯度复水、水化、抗原修复、去除内源性过氧化物酶、封闭后给予anti-SPC25 4℃孵育过夜，次日孵育二抗、链霉菌抗生物素蛋白―过氧化物酶，DAB显色，苏木素染色细胞核，封片，镜下观察。

1.7 siRNA转染胶质瘤细胞 将1×106个U87细胞接种至六孔板中，次日细胞汇合度至60%～80%时，采用lipo3000分别转染阴性对照(siRNA-NC)和特异性针对SPC25基因的(siRNA-SPC25)，正义链序列为：5'-CUUGACCUGUCCAACAACAUU-3',反义链序列为3'-UUGAACUGGACAGGUUGUUGU-5'，转染后48 h分别提取细胞蛋白和RNA，采用Western blot和荧光定量PCR检测SPC25的沉默效果。

1.8 MTS实验 分别将1×103个U87-siRNA-NC和U87-siRNA-SPC25细胞接种至96孔板中，每孔4个重复，连续接种五块板，每日分别向其中1块板中加入20 μL MTS试剂，3 h后采用紫外分光光度计检测490 nm波长下吸光度值，分析其增殖率。

1.9 集落形成实验 分别向6孔板中接入500个U87-siRNA-NC和U87-siRNA-SPC25细胞，连续培养14 d，采用1%结晶紫染色10 min，PBS冲洗后观察形成的集落数，集落形成率=(集落形成数/500) ×100%。

1.10 统计学处理 采用SPSS22.0统计学软件，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，患者生存时间分析采用Kaplan-Meier分析，全部实验重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析 TCGA胶质瘤数据库分析结果显示， SPC25 mRNA在528例胶质瘤组织中的平均表达水平(-0.23±0.41)高于10例正常脑组织(-1.72±0.45)，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图1A。进一步采用Kaplan-Meier分析SPC25表达水平与胶质瘤患者生存率的关系，结果显示SPC25高表达的胶质瘤患者(50例)平均生存时间为13.6个月，SPC25低表达患者(40例)平均生存时间为14.8个月，差异具有统计学意义(P=0.03)，见图1B。

B

2.2 SPC25在胶质瘤组织中的表达 90例胶质瘤组织中SPC25蛋白和mRNA表达水平均高于10例对照脑组织，其表达水平随胶质瘤病理分级级别的升高依次增高，见封三图1。SPC25高表达的胶质瘤患者(50例)平均生存时间为22.4个月，SPC25低表达患者(40例)平均生存时间为29.5个月，差异有统计学意义(P=0.029)，见封三图2。

2.3 SPC25对胶质瘤细胞增殖的影响 Western blot和荧光定量PCR结果显示，与U87-siRNA-NC细胞比较，U87-siRNA-SPC25细胞中SPC25蛋白呈低表达，见封三图3。MTS结果显示，U87-siRNA-SPC25细胞的吸光度值低于U87-siRNA-NC细胞，差异具有统计学意义(P<0.01)，见封三图4A。集落形成实验结果显示，U87-siRNA-SPC25集落形成率低于U87-siRNA-NC，差异具有统计学意义(P<0.01)，见封三图4B。

3 讨论

研究发现，SPC25在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中均存在异常的高表达现象，SPC25的过表达可促进肝癌、前列腺癌、乳腺癌细胞的生长和侵袭[7-10]。裸鼠成瘤实验证实SPC25过表达可导致小鼠生存时间显著缩短，在前列腺癌细胞中沉默SPC25的表达，肿瘤细胞的生长和侵袭活性显著受到抑制，荷瘤裸鼠的生存时间显著延长[10]。前列腺癌干细胞存在过高的SPC25表达，SPC25过表达的前列腺癌细胞系具有更为典型的胶质瘤干细胞特征[10]。

本研究采用生物信息学技术，TCGA胶质瘤数据库分析结果显示，SPC25在胶质瘤组织中的平均表达水平明显高于正常脑组织，SPC25高表达胶质瘤患者平均生存时间明显低于低表达患者。同时，本研究分别采用Western blot、荧光定量PCR和免疫组化检测90例胶质瘤组织和10例对照脑组织中SPC25蛋白和mRNA表达水平，结果显示胶质瘤组织中SPC25表达水平明显高于对照脑组织，SPC25高表达的胶质瘤患者平均生存时间明显低于低表达患者。本研究进一步构建siRNA，沉默胶质瘤细胞U87中SPC25的表达，MTS和集落形成实验结果均显示，U87-siRNA-SPC25细胞的吸光度值和集落形成率均明显低于U87-siRNA-NC细胞。

综上所述，有丝分裂调控相关基因SPC25在胶质瘤中存在高表达现象，可促进胶质瘤细胞的生长，导致胶质瘤患者的不良预后结局，SPC25可能为胶质瘤治疗研究的潜在靶点。