超高效液相色谱法测定化妆品中15种防晒剂含量

李祥胜，高家敏

作者单位：1安徽省食品药品检验研究院化妆品室，安徽 合肥230051；

2中国食品药品检定研究院化妆品所，北京100050

紫外线辐射对人类的健康有很多的不利影响。地球表面的紫外线由90%以上UVA（320～400 nm）和10%以下的UVB（290～320 nm）构成。UVA 能穿透真皮，使其产生黑色素，形成晒黑，UVB 则能穿过角质层，引起皮肤伤害，出现红斑。防晒剂在一定程度上对皮肤起到了保护作用，一般分为物理防晒剂和化学防晒剂，其中化学性防晒剂具有较高紫外线吸收性能的优点。各类防晒剂对人体的安全性并不一样，如使用过量可能会引起皮肤过敏反应和刺激反应，因此，国际和国内对化学防晒剂的使用种类和使用量都有严格的管理和限制，我国的《化妆品安全技术规范》（2015年版）对其中的25种化学防晒剂进行了明确的限量，并采用高效液相色谱（HPLC）法对其中的苯基苯并咪唑磺酸等15 种防晒剂进行含量测定，但该方法在实际的检测中存在一定局限性，使用原梯度条件洗脱，无法将色谱峰完全分开，且使用原供试品溶液制备方法，无法很好地同时对15种组分进行充分溶解提取，导致不能准确地进行定性和定量分析。本研究自2019年1—4月在参考相关文献的基础上，通过试验采用超高效液相色谱（UPLC）法进一步完善和优化了该方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AcQuity UPLC，PDA 检测器（Waters，美国）；XP205 型电子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；超声清洗仪（Elma，德国）；Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国）。甲醇、四氢呋喃均为色谱纯；高氯酸为分析纯；15 种防晒剂标准品：苯基苯并咪唑磺酸（批号G01234，纯度99.9%，USP REFERENCE STANDARD）、二苯酮-4（批号20104，纯度99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、对氨基苯甲酸（批号40717，纯度99.9%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、二苯酮-3（批号14971，纯度100%，AccuStandard）、对甲氧基肉桂酸异戊酯（批号H1860050，纯度98.0%，ANPEL）、4-甲基苄亚基樟脑（批号90217，纯度99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、PABA 乙基己酯（批号H1E172，纯度99.2%，USP REFERENCE STANDARD）、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷（批号H0G220，纯 度99.5%，USP REFERENCE STANDARD）、奥克立林（批号90701，纯度98.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、甲氧基肉桂酸乙基己酯（批号40916，纯度99.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）、水杨酸乙基己酯（批号G0D278，纯度99.5%，USP REFERENCE STANDARD）、胡莫柳酯（批号H0D322，纯度99.4%，USP REFERENCE STANDARD）、乙基己基三嗪酮（批号F0H178，纯度99.5%，USP REFERENCE STANDARD）、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚（批号F0F222，纯度99.8%，USP REFERENCE STANDARD）、双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪（批号F0G275，纯度98.7%，USP REFERENCE STANDARD）；混合溶液［V（甲醇）∶V（四氢呋喃）∶V（水）∶V（高氯酸）=250∶450∶300∶0.2］。

1.2 溶液的配制

1.2.1 混合标准溶液的配制 精密称取上述15 种标准品适量，分别置于10 mL 棕色量瓶中，前7 种标准品先加混合溶液适量（苯基苯并咪唑磺酸先滴加1 mol/L 氢氧化钠溶液1 mL 使其溶解），超声使溶解并用混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为各单标储备液；后8种标准品先加四氢呋喃适量，超声使溶解并用四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，作为各单标储备液。精密量取各单标储备液适量，置50 mL量瓶中，用混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合标准溶液A；精密量取混合标准溶液A 1.0 mL，置10 mL 量瓶中，用混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合标准溶液B。

1.2.2 样品处理 称取样品约0.25 g，精密称定，置于25 mL离心管中，加入四氢呋喃5 mL，涡旋使样品溶散，加入上述混合溶液，定容，混匀，超声振荡30 min，精密量取提取液1.0 mL，再用混合溶液稀释至10.0 mL，摇匀，经0.22 μm 滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：CORTECSUPLCC18（1.6 μm ，2.1 mm×150 mm）；检测波长：311 nm；柱温：35 ℃；流速：0.2 mL/min；流动相：A 为φ（甲酸）=0.1%，B 为V（甲醇）∶V（乙醇）=3∶1；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）色谱条件，苯基苯并咪唑磺酸、二苯酮-4、对氨基苯甲酸三种成分的色谱峰保留时间过短、分离度差，且二苯酮-4/二苯酮-5 色谱峰拖尾，在检测中极易受到样品杂质峰的干扰，在实际检测中如果改变洗脱程序延缓上述三种成分的出峰时间以提高其分离度，会导致后面成分的出峰时间过长，不利于工作效率的提高；四氢呋喃和高氯酸对色谱系统管路有较强的腐蚀性。本研究通过使用UPLC 法，改变流动相组分，进行梯度洗脱，15 种防晒剂组分的色谱峰均得到了很好的分离，色谱系统稳定，且在实际检测样品过程中，仪器连续运行一周，15 种防晒剂组分保留时间的相对标准偏差为0.4%～0.6%，可充分满足大批量样品检测的要求；相比HPLC 法节约了80%的流动相，降低了有机溶剂的消耗、节能环保（图1）。

2.2 供试品溶液制备方法优化

由于15 种防晒剂的极性存在较大差异，参照《化妆品安全技术规范》（2015 年版）样品处理第一法（不含蜡质的样品）制备供试品溶液时发现，使用上述混合溶液分散溶解供试品时，极性小的待测组分提取效率较差，导致极性小的待测组分测定结果偏低甚至造成假阴性；而当参照样品处理第二法（含蜡质的样品）制备供试品溶液时发现，使用四氢呋喃分散溶解供试品时，极性大的待测组分提取效率较差，也易导致极性大的待测组分测定结果偏低甚至造成假阴性；综合上述结果，本文采用先加入适量四氢呋喃涡旋使样品溶散，再加入上述混合溶液，超声振荡制备供试品溶液，结果显示该法能同时满足对15种防晒剂组分的充分溶解提取。

2.3 线性关系及检出限

精密量取上述混合标准溶液B 稀释制成系列浓度标准溶液，在上述“1.3”试验条件下，精密量取1 μL 分别注入UPLC，以峰面积为纵坐标、进样浓度为横坐标，绘制标准曲线；以3 倍信噪比计算检出限；各成分线性关系良好，相关系数（r）均不小于0.999；线性范围较宽，可满足实际工作中不同浓度样品测定的要求；检出限为0.000 7%～0.02%，均满足《化妆品安全技术规范》（2015年版）检出限的要求（表2）。

2.4 精密度及溶液稳定性试验

精密吸取“1.2.1”中的混合标准溶液B 1.0 μL，照上述的试验条件连续进样测定6 次，记录各组分的峰面积，计算RSD；同时取此溶液每隔6 小时进样测定，结果表明进样精密度良好，溶液中各组分在1周内均稳定。

2.5 回收率的测定

在上述实验条件下，向空白基质中加入各防晒剂的标准溶液适量，按样品前处理方法进行处理，用上述的各标准曲线计算回收率，各成分回收率为93.9%～104.2%，均可满足测定准确度的要求（表3）。

2.6 检出防晒剂统计

用本研究建立的UPLC色谱法对市售70批防晒剂样品进行了含量测定分析，除去两批物理防晒剂样品中未检出上述15 种防晒剂成分外，其余68批样品中检出1至6种不同防晒剂，均符合《化妆品安全技术规范》（2015 年版）的限度规定，防晒剂总含量从3.4%至24.7%不等，但目前没有相关法规对防晒剂总量进行控制；68 批样品中15 种防晒剂成分检出频次也不尽相同，其中对氨基苯甲酸、二苯酮-4、PABA 乙基己酯三种均未检出，有57批样品中检出甲氧基肉桂酸乙基己酯，频次最高，具体检出频次为检出甲氧基肉桂酸乙基己酯57次，丁基甲氧基二苯酰基甲烷及双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪24 次，乙基己基三嗪酮及亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚21 次，水杨酸乙基己酯20次，奥克立林19次，二苯酮-3 17次，4-甲基苄亚基樟脑15次，苯基苯并咪唑磺酸12次，胡莫柳酯5次，对甲氧基肉桂酸异戊酯3次，未检出对氨基苯甲酸、二苯酮-4及PABA乙基己酯。

图1 15种防晒剂色谱图

表2 线性方程、相关系数、线性范围及检出限

表3 回收率测定结果

3 讨论

本方法在《化妆品安全技术规范》（2015 年版）苯基苯并咪唑磺酸等15种组分的检测方法基础上，对样品的前处理进行了一定的优化，使检测结果更加准确可靠；通过将HPLC 法改为UPLC 法，使得15种防晒剂实现基线分离，提高了定量的准确性，同时也大量减少有机溶剂的使用；对流动相组分进行调整，替换了原来流动相中易爆、强腐蚀性的高氯酸和四氢呋喃，减少对超高效液相色谱仪管路系统的腐蚀和对环境的污染。回收率、精密度及溶液稳定性试验均表明本方法用于化妆品中15 种防晒剂的测定，结果准确、可靠。