LncRNA-ROR在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用*

朱长明，孙 高，陈功华，龚于刚，夏 杰

(1.吉首大学附属张家界市人民医院胃肠外科，湖南 张家界 427000；2.吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率极高，胃癌发生远处转移是导致患者死亡的主要原因，在实体肿瘤的成长过程中伴随着复杂的微环境改变，而缺氧微环境的诱导是加剧胃癌侵袭转移的重要因素.因此，探讨缺氧条件下胃癌侵袭转移的机制至关重要[1-3].长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸且不具有蛋白质编码功能的长链RNA分子，具有丰富的生物学功能[4-5].目前，大量研究已证实LncRNA在缺氧诱导的胃癌侵袭转移中发挥了重大作用.LncRNA-ROR(Regulator of Reprogramming)，是最近发现的对细胞重编程过程具有重要调控作用的长链非编码RNA[6-7]，目前研究发现LncRNA-ROR在乳腺癌、肝癌、结肠癌、肾癌等肿瘤中存在差异表达，在肿瘤的发生、转移及耐药等方面发挥重要的调控功能[8-11].然而，LncRNA-ROR在缺氧诱导胃癌中的作用尚不清楚.基于此，本研究采用基因重组技术过表达LncRNA-ROR，研究其对缺氧诱导的胃癌细胞侵袭转移能力的影响.

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年8月至2013年3月收集30例厦门大学附属中山医院胃肠外科胃癌患者的手术切除标本(配对癌旁正常组织距离癌灶5 cm以外)，所选患者术前均未接受放化疗.所有收集的样本均立即放入液氮冻存，随后转入-80 ℃冰箱保存，整个收集及保存过程均按照无酶操作原则进行.本研究经厦门大学附属中山医院伦理委员会批准，所有纳入患者均在术前签署知情同意书.

1.2 细胞株及细胞培养

人胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901购于中科院上海细胞库，MGC-803和SGC-7901均用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液(美国Gibco公司11875-093)进行培养，培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱和37 ℃、5%CO2+1%O2+94%N2的缺氧孵箱中培养.取状况良好、处于对数生长期的细胞进行试验.

1.3 基因重组及慢病毒转染LncRNA-ROR

过表达序列(LV5-ROR)的设计与合成及慢病毒载体构建、包装均由上海生工生物工程有限公司完成.ROR空载体(LV5-NC)作为对照，利用慢病毒法进行细胞感染，培养3～4 d后采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测LncRNA-ROR过表达效果.

1.4 总RNA提取、cDNA反转录及RT-PCR检测

利用RNAiso Plus裂解液(日本TaKaRa公司，9109)提取组织及细胞的总RNA，PrimeScript反转录试剂盒(日本TaKaRa公司，RR047A)反转录成cDNA，SYBR Premix Ex Taq II(日本TaKaRa公司，RR820L)进行RT-PCR反应.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，引物序列购于上海生工生物工程有限公司.LncRNA-ROR引物上游序列：CCAGGACAATGAAACCAC；下游序列：AGGAGCCCAAAGTAACAG.GAPDH引物上游序列：GTCAACGGATITGGTCTGTATT；下游序列：AGTCTTCTGGG-TGGCAGTGAT.

1.5 细胞迁移及侵袭试验

用无血清培养基将转染后的细胞配置成细胞悬液，迁移试验细胞浓度为4×104个，侵袭试验细胞浓度为1×105个；取100 μL细胞悬液加入小室的上室，下层小室为500 μL含10%FBS的培养基，分别置于常氧、缺氧培养箱孵育24 h后，取出小室，用棉签轻拭小室上层，下层于-20 ℃下用4%多聚甲醛固定15～20 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS溶液洗去残余的结晶紫并风干，倒置于400倍显微镜(Tsl00，13本Nikon公司)下观察，每个样本随机取5个视野，取其平均值作为细胞的迁移及侵袭数量.每组试验均重复3次以上.

1.6 统计学方法

试验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料数据以均值±标准差(Mean±SD)表示，组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，配对资料间使用独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 ROR mRNA在胃癌组织中表达下调

通过RT-PCR法检测30例患者胃癌组织及癌旁组织中ROR mRNA表达水平.结果表明，ROR mRNA的在胃癌组织中表达明显低于癌旁组织(图1).

图1 RORmRNA在胃癌及癌旁组织中的表达情况

2.2 ROR mRNA在缺氧诱导的胃癌细胞系中表达水平明显下调

通过RT-PCR法检测了在缺氧诱导下胃癌细胞系SGC-7901及MGC-803中ROR mRNA表达水平.结果表明，在缺氧诱导下，SGC-7901及MGC-803中ROR mRNA表达水平明显降低且均在缺氧16 h时最低(图2).

图2 ROR mRNA在缺氧诱导胃癌细胞系SGC-7901及MGC-803中的表达情况

2.3 基因过表达技术增高ROR mRNA在胃癌细胞系中的表达水平

利用基因过表达技术，构建ROR mRNA过表达的LV5-ROR慢病毒载体，以空载的LV5-NC慢病毒载体作为对照，利用慢病毒法转染胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，再采用RT-PCR法检测转染后细胞中ROR mRNA表达水平.如图3所示，与空载对照组相比，转染LV5-ROR细胞系中的ROR mRNA表达水平显著增高(P<0.001).

图3 ROR mRNA在胃癌细胞SGC-7901及MGC-803中的过表达效果(***P<0.001)

2.4 ROR mRNA在缺氧诱导下抑制胃癌细胞的侵袭和迁移

Transwell迁移及侵袭试验结果表明，在缺氧条件下SGC-7901与MGC-803的侵袭能力明显增强.而在缺氧条件下，与LV5-NC相比，LV5-ROR转染SGC-7901和MGC-803后，两种胃癌细胞的迁移、侵袭能力均明显降低(图4，5).

图4 缺氧条件下过表达ROR mRNA后对胃癌细胞SGC-7901侵袭及转移能力的影响(**P<0.01)

图5 缺氧条件下过表达ROR mRNA后对胃癌细胞MGC-803侵袭及转移能力的影响(**P<0.01)

结果证实了缺氧能够显著增加SGC-7901和MGC-803的侵袭、转移能力；在过表达ROR mRNA后，缺氧诱导胃癌细胞的侵袭、转移能力明显下降，这充分表明了在缺氧条件下ROR mRNA能抑制胃癌细胞的侵袭及转移.

3 讨论

在众多肿瘤疾病中，胃癌的发病率及死亡率均居前列，而在占全球胃癌患者总数60%的亚洲国家中，中国是胃癌患者最多的国家.尽管诊疗技术在不断提高，以手术治疗为主的综合治疗手段越来越丰富，但胃癌的预后仍然很差，影响胃癌患者预后的主要因素是发生远处转移[12-13].众所周知，在实体肿瘤的发生及发展过程中，普遍存在缺氧现象，缺氧能改变肿瘤生长的微环境，促进肿瘤多种恶性表型发生，在缺氧诱导下，众多基因表达高度异常，通过各种不同的作用机制刺激肿瘤的侵袭及转移[14-16].

在过去几十年里，专家学者致力于蛋白编码基因的相关研究，但在人类基因组序列中，有超过98%的序列并不能编码蛋白质，而LncRNA曾一度被认为是基因转录噪音而未受到重视.现在大量的数据表明，LncRNA具有丰富的生物学功能，其广泛的调控机制及在疾病进程中作用越来越受到人们的重视[17-18].LncRNA-ROR位于第18号染色体，全长2.6kb，由4个外显子组成.2010年科研人员在研究LncRNA与诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)的关系中发现，ROR可通过介导转录因子的表达进而调控细胞重编程过程[6].

本研究结果表明，在胃癌组织中，ROR mRNA的表达量明显低于癌旁组织；此外，在缺氧环境下诱导胃癌细胞系8，16，20，24 h后，检测ROR mRNA的表达水平，发现缺氧诱导后ROR mRNA的表达量明显降低，由此证明在缺氧诱导下，ROR mRNA在胃癌中存在差异表达.随后本研究构建了ROR mRNA过表达的LV5-ROR慢病毒载体，通过慢病毒法转染胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803，再利用Transwell小室试验研究在缺氧诱导下LV5-ROR对胃癌细胞的侵袭、迁移能力的影响.结果表明，在缺氧条件下，过表达ROR mRNA后，胃癌细胞的侵袭、迁移能力明显降低，由此证明ROR mRNA在胃癌的侵袭转移中发挥了重要的作用.本研究初步揭示了在缺氧诱导条件下LncRNA-ROR对胃癌侵袭及转移的作用，但其具体机制仍不清楚，有待一步研究，为将来胃癌的诊断及治疗提供研究基础.

4 结论

LncRNA-ROR在胃癌中存在差异表达，ROR mRNA在胃癌组织中的表达低于癌旁组织；在缺氧诱导下，胃癌细胞中ROR mRNA表达明显下降；缺氧时过表达ROR mRNA能够明显抑制SGC-7901及MGC-803细胞的侵袭、转移.综上，LncRNA-ROR具备抑制胃癌细胞侵袭及转移的能力，可为胃癌靶向治疗提供理论依据.