核磁共振磷谱法测定乳制品中的酪蛋白含量

冯翠萍，刘一诺，樊双喜，武竹英，钟其顶,3,*

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；2.全国食品发酵标准化中心，北京 100015；3.国家食品质量监督检验中心，北京 100015）

核磁共振磷谱（31P nuclear magnetic resonance，31P NMR）从1985年就开始应用于食品领域，现已在食品中有广泛的应用[1-8]。31P NMR灵敏度约为氢谱的6.64%，是碳谱的377 倍，化学位移范围很宽，且无四极矩效应，因此有很好的灵敏度和分辨率，用于定量分析有较大的优势。酪蛋白是乳品中主要的蛋白组分，主要包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，都是含磷的蛋白质[9-10]，所以可用31P NMR进行检测。

酪蛋白进入机体后在胰蛋白酶等作用下，水解成酪蛋白磷酸肽，研究表明酪蛋白磷酸肽具有促进小肠对矿物质尤其是钙的吸收，促进牙齿、骨骼中钙的沉淀和钙化及增强机体免疫力等功效[10-13]。酪蛋白是牛奶及其他乳制品中最主要的蛋白质，牛奶中的酪蛋白约占蛋白总量的80%～90%。酪蛋白含量是衡量牛奶及其他乳制品营养价值的一个重要指标[14]。部分乳制品生产厂家为降低成本，用明胶、乳清粉、大豆分离蛋白等代替乳蛋白，因此仅测定总蛋白质含量，不能检出是否掺假。酪蛋白作为牛乳中的一种特征蛋白质，其质量分数约为2.6%，很少受到季节、饲料等因素的影响。所以检测酪蛋白的含量可作为判定乳制品中经济掺假行为的重要指标[14]，因此，亟需建立一种快速且准确性高的定量检测乳制品中酪蛋白的方法。

目前我国GB 31638ü 2016《酪蛋白》中已提出酪蛋白的指标，并在附录A中指定了测定方法，即常规测定乳制品中酪蛋白的方法[15-17]，先用等电沉淀法提取乳制品中的酪蛋白，再用GB 5009.5ü 2016《食品中蛋白质的测定》第一法或第二法测定。提取酪蛋白的过程步骤较多，用时较长，不确定的因素多，所以误差较大。蛋白质的测定方法中第一法或第二法也各有其缺点，第一法凯氏定氮法，灵敏度低，用时长（8～10 h），含氮的其他物质对测定会造成干扰，如三聚氰胺事件。第二法分光光度法，嘌吟和嘧啶及各种核苷酸对检测会造成干扰，干扰物质多，准确度也较差。对于高温消毒的牛奶，因加热的过程中乳清蛋白可能和酪蛋白产生共价键连接，用常规方法会造成测定结果偏大。有相关研究报道采用纳米材料BSPOTPE测定奶粉中酪蛋白的含量[18]，这种方法依赖于BSPOTPE纳米材料，且样品中和酪蛋白分子大小相似的物质，如脂肪会对测定造成干扰。也有报道用同位素稀释质谱法测婴幼儿配方奶粉及牛乳、乳粉为原料的饮料中酪蛋白的含量[19-20]，但仍需用等电沉淀法提取酪蛋白，再加入多肽同位素内标和胰蛋白酶进行酶解16 h，用高效液相色谱-质谱联用法进行定量分析，检测所需时间长，步骤繁琐。酶联免疫法[21]同样需要首先提取酪蛋白，再依赖特异性的抗体实现检测，且属于半定量的检测方法。聚合酶链式反应技术[22]需要获取相关的基因片段、昂贵的设备和专业人才，应用有一定的限制；毛细管电泳法[23]准确性不够高，也不能广泛应用于各类乳品的检测。所以还没有一种简单快速且准确性高的定量检测乳制品中酪蛋白的方法。

基于以上问题将31P NMR用于测定乳制品中酪蛋白的含量，旨在建立一种快速、准确、实用的酪蛋白定量检测方法。相比于现有酪蛋白测定方法，前处理简单快速，高温灭菌等处理也不会对测定结果造成影响，测定的干扰因素少，准确性高。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白标准品（C5890） 美国Sigma-Aldrich公司；亚甲二膦酸（≥98%） Aladdin试剂（上海）有限公司；二水合乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，≥99%）、叠氮化钠（高纯）北京博奥拓达科技有限公司；重水（D2O，99.9%）青岛腾龙微波科技有限公司；氢氧化钠（分析纯）北京化工厂；水为GB/T 6682ü 2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水；不同品牌的各类乳制品购于北京某大型超市。

1.2 仪器与设备

Avance III HD 400M波谱仪（配备BBO探头、SampleJet自动进样器、SampleJet 5 mm高通量核磁管、pH计） 德国Bruker Biospin公司；MX-S涡旋混合器大龙兴创实验仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EDTA溶液配制

准确称取1.86 g EDTA溶于8 mL水中，在涡旋混合器上充分混合，用1 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至8.0，使EDTA充分溶解于水中，再加入1 mg叠氮化钠，充分摇匀，然后转移至10 mL容量瓶，用D2O定容至10 mL。

1.3.2 亚甲二磷酸溶液配制

准确称取0.352 g亚甲二磷酸，用涡旋混合器充分溶解于8 mL水中，完全转移至10 mL容量瓶中，定容至10 mL。

1.3.3 酪蛋白标准品溶液配制

准确称取5.00 mg酪蛋白标准品，溶于800 µL去离子水中，再加入10 µL 200 mmol/L的亚甲二磷酸、100 µL 0.5 mol/L EDTA，充分摇匀，用1 mol/L的NaOH-D2O溶液调pH值为9.5，再用氘水稀释至1 mL，得到质量浓度为5.00 g/L的酪蛋白标准溶液，取600 µL于核磁管中测定；用同样的方法配制10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00 g/L的酪蛋白标准品溶液，并分别取600 µL于核磁管中测定。

1.3.4 样品的制备

1.3.4.1 液体奶样品制备

准确吸取800 µL液体奶，加入10 µL 200 mmol/L的亚甲二磷酸溶液，100 µL 0.5 mol/L EDTA，充分摇匀。再用1 mol/L的NaOH-D2O溶液调pH值为9.5，再用氘水稀释至1 mL。8 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃去上层脂肪，取600 µL于核磁管中测定。对于高钙液体奶，先用水稀释，再配制，稀释的比例为液体奶和水的体积比为3∶1。

1.3.4.2 奶粉样品制备

称取200 mg奶粉样品溶于1 mL水中，充分摇匀。以下步骤同液体奶样品配制。

1.3.4.3 酸奶样品制备

准确称取5 g酸奶，用1 mol/L NaOH溶液调pH值为9.5，然后准确称量调完pH值的酸奶质量。以下步骤同液体奶样品配制。

1.3.4.4 奶片样品制备

将奶片研磨成粉末，称取200 mg奶片粉末样品溶于1 mL水中，充分摇匀。以下步骤同液体奶样品配制。

1.3.531P NMR上机测试参数

采用BBO探头，31P的共振频率为161.97 MHz，Bruker Top Spin 3.5软件用于31P NMR谱图数据的采集；扫描次数1 700；谱宽5 000 Hz；中心频率106；弛豫延迟时间2 s；采样时间1.6 s；检测温度300 K；布鲁克的标准脉冲序列zgig30；检测核为31P。

1.3.6 精密度分析

选取一个样品溶液，同一天内连续测定5 次，取平均值，分析方法的日内精密度；连续测定5 d，每天测定5 次取平均值，分析方法的日间精密度。

1.3.7 回收率实验

配制样品20 份，其中5 份作为对照组，其余15 份由低至高，分别添加5.00、10.00、15.00 g/L 3 个不同质量浓度水平的酪蛋白标准品，在1.3.5节的条件下测定其31P NMR，计算回收率和相对标准偏差。

1.3.8 方法对比

将31P NMR定量检测乳品中酪蛋白的方法与食品安全国家标准GB 31638ü 2016附录A中指定的酪蛋白测定方法用于检测同一批样品，对检测结果进行对比分析，验证检测方法的准确性。

1.4 数据处理

采用MestReNova 12.0软件（Mestrelab Research S.L.，MestReNova（Mnova）NMR，USA）对31P NMR谱图进行傅里叶变换、基线矫正、相位调整。线宽因子为3。相位校正选择metabonomics算法，先自动优化，后针对特定区域进行手动校正，使尽可能多的积分值为正值。基线校正选择polynomial fit拟合方式。

2 结果与分析

2.1 乳制品中酪蛋白含量31P NMR谱定量方法选择

在乳制品中磷以多种形式存在，包括在乳清蛋白和酪蛋白胶束中和钙结合的无机磷，以及与酪蛋白、脂类和碳水化合物等分子以共价结合的有机磷。在31P NMR中，乳制品中和酪蛋白以共价键结合的磷酸酯和其他形式存在的磷能够很好地分离[24-25]。向乳制品中加入EDTA消除钙离子干扰的前提下，将样品的pH值调至碱性，不同的酪蛋白可在同一个位置出峰，为定量提供了便利[24,26]。

由于乳制品中的酪蛋白是混合物，不能用常规的内标法或外标法定量，所以采用酪蛋白标准品制作标准曲线，再用插值法得到牛奶中酪蛋白含量，具体步骤如下：首先测定加入固定量内标物质的酪蛋白标准品的磷谱，将酪蛋白标准品和内标物质积分面积比值作横坐标，酪蛋白标准品浓度作纵坐标，得到线性回归方程y=ɑx+β，再用相同条件测定用相同方法制备的乳制品样品的磷谱，得到样品中酪蛋白和二甲基磷酸积分面积比值，用插值法得到乳制品样品中酪蛋白的含量。

也可以选择不用内标物质，将酪蛋白标准品积分面积的绝对值作横坐标，酪蛋白标准品浓度作纵坐标，得到线性回归方程y=ɑx+β，再用相同方法得到样品中酪蛋白的绝对积分面积，用差值法得到样品中酪蛋白的含量。如果不用内标物质，对于内标物和样品测试参数和处理参数必须完全一致，如线宽因子、傅里叶变换点数、基线矫正方法、积分方法、积分范围等。为降低测试及谱图处理等因素对结果造成影响，选择使用内标物质的方法。

2.2 标准品选择

牛乳制品中酪蛋白含量会随着季节等因素有较小幅度的改变，但酪蛋白中磷含量稳定[17]。不同种类乳制品，酪蛋白中磷含量会有差别[27]，如测定羊乳制品中的酪蛋白含量，应选用相对应的酪蛋白标品作标准曲线，否则会对定量结果的准确性造成影响。

2.3 内标物质、定量峰、积分区域选择

内标物质应满足一般核磁定量测试对内标物质的要求，即内标物质不与待测样品反应，能溶于待测样品，内标物质信号不和待测样品中信号重叠，且内标物质信号峰和待测物质定量信号峰位移相差不应太大。亚甲二磷酸可溶于牛奶，其磷谱信号不和牛奶中各种磷信号重叠，且和酪蛋白的位移值相差较小，因此选用亚甲二磷酸作为内标物质。

由图1可知，当内标亚甲二磷酸信号位移定为δ16.13时，δ3.89处的多峰为酪蛋白定量峰，亚甲二磷酸积分区域为δ16.75～15.60，酪蛋白积分区域为δ4.41～3.45。

图1 乳制品样品的31P NMR谱图Fig.1 31P NMR spectrum of dairy sample

2.4 检测参数优化

按照常规的核磁定量方法，为保证定量准确，弛豫延迟时间应大于5 倍的纵向弛豫时间，使得信号得到完全弛豫。根据文献[28]可知，与酪蛋白结合的磷酸酯的31P NMR纵向弛豫时间为2 s，亚甲二磷酸31P NMR的纵向弛豫时间为6 s，所以弛豫延迟时间至少应为30 s，样品检测时间太长。采用先作标准曲线，再用插值法得到样品中酪蛋白含量时，不需要保证测试过程中磷的信号完全弛豫，只需保证相同的测试时间，定量信号有较高的信噪比（RSN），标准曲线有较好的线性。

测试时间均为1.7 h，弛豫延迟时间在0.5～16 s分别测试得到谱图（图2）。弛豫延迟时间从0.5 s降至2 s，RSN相差较小，弛豫延迟时间不小于4 s时，RSN逐渐降低。按照1.3.3节的方法配制酪蛋白标准品溶液，弛豫延迟时间分别为0.5 、1 、2 s，采样次数分别为2 900、2 350、1 700，使得测试时间均为1.7 h，1.3.5节中其他测试参数不变测试得到谱图，以酪蛋白定量峰的积分面积和内标物定量峰的积分面积比值作横坐标，酪蛋白的浓度作纵坐标，得到线性回归方程，相关系数R2分别为0.958 8、0.960 0、0.999 6，可见弛豫延迟时间为2 s时有较好的RSN和线性，所以本实验采用弛豫延迟时间为2 s，采样次数为1 700。

图2 相同测试时间时不同弛豫时间得到的酪蛋白NMR谱图Fig.2 NMR spectra of casein obtained with different relaxation times at the same test time

2.5 方法学考察结果

2.5.1 线性关系

以酪蛋白积分面积和内标物积分面积比值作横坐标，酪蛋白质量浓度作纵坐标，得到线性回归方程y=18.439x+0.069，R2=0.999 6，可见线性关系良好。

2.5.2 精密度分析

用同奶粉样品相同的方法对液体奶、酸奶、奶片样品进行日内精密度和日间精密度分析。如表1所示，奶粉样品的日内精密度和日间精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.65%和1.40%；液体奶样品的日内精密度和日间精密度RSD分别为0.87%和1.62%；酸奶样品的日内精密度和日间精密度RSD分别为0.90%和1.75%；奶片的日内精密度和日间精密度RSD分别为1.4%和1.80%。日内与日间两者酪蛋白测定结果均无显著性差异（P＞0.05）。

表1 精密度实验结果（n=5）Table 1 Precisions of the method (n= 5)

2.5.3 回收率实验

将液体奶和酸奶用水稀释1 倍，奶片研磨成粉末，均用与奶粉样品相同的方法做回收率实验。如表2所示，该方法的回收率在91.94%～105.10%范围区间，回收率的RSD在0.87%～1.50%范围区间，可见奶粉、液体奶、酸奶、奶片中酪蛋白检测方法精确度较好，能够满足酪蛋白含量准确测定要求。

表2 方法回收率实验结果（n=5）Table 2 Recovery of spiked samples (n= 5)

2.5.4 检出限与定量限

将酪蛋白标准品谱图RSN为3时的质量浓度作为检出限，酪蛋白标准谱图RSN为10时的质量浓度作为定量限[19,29]。在1.3.5节及1.3.6节的测试参数及数据处理条件下，检测限为0.38 g/L，定量限为1.25 g/L。

2.5.5 方法准确性分析

将以上建立的31P NMR定量检测乳制品中酪蛋白的方法和GB 31638ü 2016附录A中指定的酪蛋白测定方法分别用于检测同一批11 个样品，每个样品重复测定2 次，取平均值，对检测结果进行对比分析，结果如表3所示，其中编号为8和9的样品为酸奶样品，样品本身的pH值低于酪蛋白的等电点，不适用于国标法测定。以国标法测定结果为横坐标，以31P NMR定量结果为纵坐标作线性回归，相关系数R2为0.999 9，国标法和31P NMR定量结果误差在±5%以内，满足方法可行性对比分析验证要求。研究表明31P NMR定量法可以用于对乳品中酪蛋白的准确测定，且更具有广泛的适用性。

表3 31P NMR定量法与国标法测定乳制品中酪蛋白含量比较Table 3 Comparison of casein contents in dairy products determined by the 31P NMR method and the national standard method

3 结 论

本实验建立了一种采用31P NMR技术对乳制品中酪蛋白定量的方法，对于现有测试条件该方法的检出限为0.38 g/L（RSN=3），定量限为1.25 g/L（RSN=10），具有较高的灵敏度，完全满足一般乳品中酪蛋白的检测需求。在5.00～35.00 g/L质量浓度范围内线性良好，相关系数R2大于0.999；加标回收率在91.94%～105.10%范围区间；日内精密度在0.65%～1.40%范围区间；日间精密度在1.40%～1.80%范围区间。31P NMR与GB 31638ü 2016测定结果误差在±5%以内，测定结果准确。该方法相比GB 31638ü 2016方法，样品用量少，前处理操作简便，对于市售的一般奶粉和液体奶样品检测单个样品的时间为1.7 h左右，如果仪器灵敏度提高或用容积大的10 mm核磁样品管，检测时间可以更短。在确保重复性、测定结果准确性的基础上，该方法极大的节约了时间与人力，大批量样品检测时成本较低，同时适用于对pH值低于酪蛋白等电点的酸奶样品中酪蛋白的检测，可广泛应用于相关检测机构以及企业日常检验、生产指导、出厂检验等方面。