Brevilaterin微胶囊化技术及缓释特性分析

宁亚维，王 瑶，侯琳琳，苏 丹，王志新，贾英民

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

随着人们对食品安全的重视，生物防腐由于高度安全性受到青睐。抗菌肽为一类具有抑菌活性的小分子多肽，可由动物、植物或微生物代谢产生[1-3]。微生物源抗菌肽因生产周期短、成本低具有较大开发潜力[4-5]。目前已经商品化的微生物源抗菌肽为Nisin，Nisin主要对革兰氏阳性细菌具有抑菌活性，但是对革兰氏阴性细菌和真菌抑菌效果不理想[6-8]。因此，需要开发具有广谱抑菌活性的抗菌肽实现食品的高效广谱抑菌。侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）抗菌肽Brevilaterin是一类广谱性抗菌肽，对食源性革兰氏阴性和阳性腐败菌和致病菌以及真菌均具有较好的抑菌活性[9]。理化性质研究表明Brevilaterin具有高度的热稳定性，在酸碱pH值环境中抑菌活性均不受影响[10]，因此Brevilaterin在食品防腐领域具有较好的开发潜力。

前期食品防腐实验研究表明，Brevilaterin对酵母菌具有抑菌活性，用于酵母菌发酵食品中会抑制酵母菌发酵从而影响食品品质。因此，本研究拟对Brevilaterin进行包埋，以使得Brevilaterin在食品体系中缓释抑菌，一方面避免对酵母菌发酵食品的酵母活性抑制，另一方面可以实现长效防腐。关于包埋技术，大多数采用β-环糊精、果胶、壳聚糖、海藻酸钠等作为壁材，对芯材进行包埋[11-13]。能否高效包埋主要取决于芯材和壁材的特性。β-环糊精具有疏水性的空腔，通常可以高效包埋疏水性物质[14-15]；果胶是广泛存在于植物细胞壁中的一种酸性多糖，一般带负电，可以通过静电相互作用吸附包埋小分子物质形成微胶囊[16-17]；壳聚糖是一种阳离子聚合物，包埋率较低[18]，经常与其他壁材形成复合包材后使用[19-20]；海藻酸钠为壁材制备微胶囊时多采用锐孔-凝固浴法，形成微胶囊粒径较大[21-23]。因此，本研究选取果胶作为壁材，研究果胶包埋抗菌肽Brevilaterin的工艺条件，初步探究包埋机制，并考察Brevilaterin果胶微胶囊的缓释特性，以期为其在食品防腐领域的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

B.laterosporusS62-9、Staphylococcus aureusATCC 25923为河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏。

果胶 北京索莱宝科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨北京奥博星生物技术有限公司；鱼蛋白胨（工业级）、消泡剂 石药集团中润制药有限公司；液糖（50%）天津市百世化工有限公司；T w e e n-2 0（分析纯）天津市红岩化学试剂厂；乙腈（色谱纯） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，色谱纯） MREDA科技（美国）有限公司；活性炭 江苏溧阳竹溪活性炭有限公司。

1.2 仪器与设备

OMP200A电子天平、PHS-3C pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；BIOTECH-5BG-7000发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；SD-Basic喷雾干燥仪 英国LabPlant公司；3-18K冷冻离心机 德国Sigma公司；T25均质机 德国IKA公司；ZETASIZER 3000HS激光粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司；2489高效液相色谱仪 美国Waters公司；Reveleris Prep快速纯化色谱仪瑞士BUCHI公司；S-570扫描电子显微镜 日本日立公司；VERTEX70傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司；STA449F3同步热分析仪 德国Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基配方

营养肉汤培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L；调节pH 7.2～7.4，121 ℃高压灭菌20 min。

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L；调节pH 7.2～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

Brevilaterin发酵培养基：液糖6%，蛋白胨1.2%，氯化钙1.38 g/L，氯化锌8.16 mg/L，0.2%吐温20；调节pH 7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.3.2 Brevilaterin的制备

将B.laterosporusS62-9从甘油管接入营养肉汤培养基中，32 ℃培养活化24 h，按照3%（V/V）比例接种，活化2 代，得到的第3代B.laterosporusS62-9菌液作为发酵用的种子菌悬液。使用5 L发酵罐，装液量60%，将发酵培养基于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌20 min后进行发酵。发酵罐转速300 r/min，发酵温度32 ℃。待培养基温度冷却至32 ℃后，将种子菌悬液按接种量5%（V/V）接种到发酵培养基中发酵24 h。发酵结束后，将发酵液121 ℃灭菌20 min，于4 ℃、8 000 r/min离心20 min，收集上清液作为Brevilaterin发酵液[24]。

采用活性炭吸附-乙醇解吸附的方法[25]从Brevilaterin发酵液中提取Brevilaterin粗品，将Brevilaterin粗品使用快速纯化色谱系统进行快速纯化。色谱柱为Flash Column C18柱（40 g），流动相A为0.1% TFA-水溶液，流动相B为0.1% TFA-乙腈溶液，检测波长220 nm，样品上样量5 mL，流速22 mL/min，洗脱方法：0～3 min，70% A、30% B；3～8 min，70%～20%A、30%～80% B；8～10 min，20% A、80% B。快速纯化后的Brevilaterin经旋转蒸发除去乙腈，然后通过冷冻干燥法冻干制得Brevilaterin备用。

1.3.3 果胶包埋Brevilaterin的工艺条件优化

1.3.3.1 Brevilaterin与果胶的Zeta电位分析

用激光粒度分析仪（4 mV HeNe激光器）在25 ℃下分别检测Brevilaterin（0.4 mg/mL）和果胶（4 mg/mL）在pH 3～9时的Zeta电位，分析Brevilaterin和果胶形成微胶囊的机制。

1.3.3.2 果胶质量浓度对包埋率的影响

分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的果胶溶液，0.4 mg/mL的Brevilaterin溶液，调节溶液的pH 5.5。在3 000 r/min、50 ℃条件下均质果胶溶液，同时向果胶溶液中逐滴滴加Brevilaterin，包埋30 min。然后于超滤离心管中4 700 r/min离心30 min，取上清液采用高效液相色谱法检测未包埋的Brevilaterin质量浓度，并计算包埋率。

1.3.3.3 pH值对包埋率的影响

分别配制0.8 mg/mL的果胶溶液、0.4 mg/mL的Brevilaterin溶液，调节溶液pH值为3、4、5、5.5、6、7。在3 000 r/min、50 ℃条件下均质果胶溶液，同时逐滴滴加Brevilaterin，包埋30 min。然后于超滤离心管中4 700 r/min离心30 min，取上清液采用高效液相色谱法检测未包埋Brevilaterin质量浓度，计算包埋率。

1.3.3.4 温度对包埋率的影响

分别配制0.8 mg/mL的果胶溶液、0.4 mg/mL的Brevilaterin溶液，调节溶液pH 5.5。在3 000 r/min条件下，30、40、50、60 ℃均质果胶溶液，同时逐滴滴加Brevilaterin，包埋30 min。然后于超滤离心管中4 700 r/min离心30 min，取上清液采用高效液相色谱法检测未包埋的Brevilaterin质量浓度，计算包埋率。

1.3.3.5 时间对包埋率的影响

分别配制0.8 mg/mL的果胶溶液、0.4 mg/mL的Brevilaterin，调节溶液pH 5.5。在3 000 r/min、50 ℃条件下均质果胶溶液，同时逐滴滴加Brevilaterin溶液，包埋10、20、30、40、50 min。然后于超滤离心管中4 700 r/min离心30 min，取上清液采用高效液相色谱法检测未包埋Brevilaterin质量浓度，计算包埋率。

1.3.4 Brevilaterin微胶囊的制备

采用喷雾干燥的方法制备Brevilaterin微胶囊。干燥参数为：进口温度170 ℃，出口温度80 ℃，进样速度6 mL/min。

1.3.5 Brevilaterin微胶囊的形态与粒径分析

通过扫描电子显微镜观察Brevilaterin微胶囊的形态。将微胶囊样品分散于样品台的双面胶上，按压使粉末粘牢，吹去多余样品，喷金后用扫描电子显微镜观察Brevilaterin微胶囊产品形态。通过激光粒度分析仪测量Brevilaterin微胶囊的粒径分布，分散介质为水，折射率为1.33，温度为25 ℃。

1.3.6 Brevilaterin微胶囊的红外光谱分析

制备Brevilaterin 微胶囊，分别称取微胶囊、Brevilaterin、果胶粉末约1 mg，加入经恒温干燥的KBr，置于研钵中研磨至混合均匀，用压片机进行压片，用傅里叶变换红外光谱仪对压片进行红外光谱扫描，扫描波数范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32 次，记录图谱。

1.3.7 Brevilaterin微胶囊的缓释效应评价

制备微胶囊粉末，利用琼脂扩散法对微胶囊的缓释效应进行研究，选择指示菌为S.aureus。首先制备指示菌平板，将过夜培养的S.aureus菌液用灭菌营养肉汤培养基稀释至OD600nm为0.7～0.8，然后按照3%（V/V）的比例接种到完全融化并冷却至50 ℃左右的营养琼脂培养基中，快速混合均匀后倒入灭菌平板（每个平板20 mL），无菌静置使其充分冷却凝固。采用打孔器在有指示菌培养基的平板上打出直径为7.5 mm的圆孔，然后称取Brevilaterin微胶囊样品粉末0.05 g填装到圆孔中，再加50 μL无菌去离子水。平板在冰箱预扩散12 h，然后放在37 ℃恒温培养箱中培养，分别于12、48、60 h观察抑菌圈直径的变化。

1.3.8 Brevilaterin微胶囊对面包防腐效果

1.3.8.1 面包的制作

分别添加3 000 AU/g的Brevilaterin微胶囊、3 500 AU/g的Brevilaterin微胶囊、1 g/kg的丙酸钙与面粉混合均匀后烤制面包，以不添加防腐剂烤制的面包作为空白对照组。面包配方如下：高筋面粉250 g、水150 mL、黄油18 g、白砂糖18 g、奶粉10 g、酵母4 g、盐3 g。把各种材料按顺序加入面包机中，使用“快速主食面包”、“500 g”、“中色”菜单进行制作。将制好的面包切片、称质量，空气中放置5 min后放于无菌密封袋中密封，然后把面包片放于28 ℃恒温培养箱中储藏，每天随机取样检测面包中的菌落数，分析Brevilaterin微胶囊对面包的防腐效果。

1.3.8.2 微胶囊对面包中霉菌生长的影响

每个实验组随机取2 片面包，分别添加一定量的无菌蛋白胨水于拍打式均质机中拍打均匀，每个样品取出5 mL进行稀释，选取合适的样品稀释液100 μL均匀涂布于孟加拉红培养基平板上，然后置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h检测菌落数，每个样品平行3 次，所得的微生物菌落总数表示为lg（CFU/g），分析Brevilaterin微胶囊的抑菌效果。

1.3.8.3 微胶囊对面包中细菌生长的影响

每个实验组随机取2 片面包，分别添加一定量的无菌蛋白胨水于拍打式均质机中拍打均匀，每个样品取出5 mL进行稀释，选取合适的样品稀释液100 μL均匀涂布于PCA培养基平板上，然后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h检测菌落数，每个样品平行3 次，所得的微生物菌落总数表示为lg（CFU/g），分析Brevilaterin微胶囊的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 Brevilaterin与果胶的Zeta电位分析

图1 Zeta电位分析Fig.1 Analysis of Zeta potential

图1 结果表明，Brevilaterin在pH 3～5范围内带正电，并且所带电荷随pH值升高逐渐减小，在pH 6时所带电荷接近于0，因此推测Brevilaterin等电点为6，pH值继续升高Brevilaterin所带电荷变为负值。果胶在pH 3～9范围内均带负电，并且所带电荷随着pH值升高逐渐增多，pH 5之后基本保持不变。因此，推测两者间存在静电相互作用，果胶可以包埋Brevilaterin。果胶包埋Nisin的研究也表明pH值可以改变Nisin电荷特性，使得果胶和Nisin通过静电相互作用力进行微胶囊包埋[26]。

2.2 Brevilaterin微胶囊制备工艺条件优化

图2 包埋条件对Brevilaterin包埋率的影响Fig.2 Effect of microencapsulation conditions on the microencapsulation efficiency of brevilaterin

图2A表明，随着果胶质量浓度增大，包埋率不断升高，当果胶质量浓度为0.8 mg/mL时，包埋率最大为98.27%，之后果胶质量浓度继续增大包埋率基本保持不变，因此选择果胶质量浓度为0.8 mg/mL。图2B表明，随着pH值升高，包埋率呈现先升高后下降的趋势，在pH 5.5时包埋率最高为97.72%。这可能是因为Brevilaterin与果胶在pH 5.5时正负电荷差值最大，因此选择pH 5.5进行Brevilaterin微胶囊制备。当pH值为7时Brevilaterin基本为电中性，此时包埋率为93.27%，说明果胶包埋Brevilaterin时不仅存在静电相互作用，可能还存在疏水相互作用等。

图2C显示，随着温度的升高，包埋率呈现先升高后降低的趋势，在50 ℃时包埋率最高为97.66%。可能是因为温度较低时果胶溶液黏度较大，不利于包埋；而温度过高果胶开始分解，包埋率降低，Brevilaterin也会有一定的损失，因此选择包埋温度为50 ℃。图2D表明，随着时间延长包埋率出现上下波动，均质30 min时包埋率最高为97.71%，这可能是因为果胶包埋Brevilaterin是一个动态的过程。为节约时间选择均质时间为30 min。

2.3 Brevilaterin微胶囊的形态与粒径分析

图3 果胶（a）和Brevilaterin微胶囊（b）的扫描电子显微镜图Fig.3 Scanning electron micrographs of pectin (a) and microencapsuled brevilaterin (b)

图3 表明，果胶粉末为不规则的块状结构，Brevilaterin微胶囊为球形或者椭球形，表面有褶皱、凹陷，推测是喷雾干燥时微胶囊内部的水分快速蒸发导致，该结果与夏慧婷等[25]用喷雾干燥法制备的橄榄油微胶囊结果一致。

图4 Brevilaterin微胶囊的粒径分布图Fig.4 Particle size distribution of microencapsulated brevilaterin

由图4可知，微胶囊的粒径图为单峰分布曲线，聚合物分散性指数为0.31，分散性良好。平均粒径为1.8 μm，粒径分布在0.6～8 μm之间，其中低于4 μm的微胶囊占90%以上，低于2 μm的微胶囊占50%以上。本研究所制备的果胶微胶囊粒径显著低于同属于抗菌肽的Nisin果胶微胶囊（平均粒径96 μm）[26]，高于王卉等[27]利用果胶与壳聚糖的静电相互作用形成凝聚物包埋Nisin（平均粒径0.45 μm），与Sun Xiuxiu等[28]利用果胶和海藻酸钠包埋制备的香芹酚微胶囊（平均粒径1.96 μm）相近。

2.4 Brevilaterin微胶囊的红外光谱分析

图5 Brevilaterin微胶囊的红外光谱图Fig.5 Infrared spectra of pectin and free and microencapsulated brevilaterin

由图5可见，Brevilaterin在837 cm-1处的吸收峰证明苯环上有对位二取代，此处是酪氨酸的特征峰，而微胶囊与果胶在837 cm-1处并没有吸收峰，说明果胶包埋了Brevilaterin；Brevilaterin在2 500～1 700 cm-1区域没有吸收峰，说明抗菌肽结构中无三键和累积双键，1 750 cm-1处是果胶羧基、羧甲基组的C＝O伸缩振动，而微胶囊在1 745 cm-1处有一个向右偏移的特征峰，说明果胶与抗菌肽形成了共轭，证明果胶包埋了Brevilaterin；3 650～3 200 cm-1处是Oü H的伸缩振动峰，物质中氢键越多峰形就会变得越宽，同时峰的最高点也会向低波数方向移动[29]，微胶囊在此处的波形明显变宽，因此推测果胶包埋Brevilaterin形成微胶囊时存在氢键作用。

2.5 Brevilaterin微胶囊的抑菌活性

采用琼脂扩散法检测，图6显示微胶囊有抑菌活性。在冰箱中预扩散12 h，然后培养箱中培养12 h后微胶囊的平均抑菌圈为15.6 mm；培养箱中培养48 h后微胶囊的平均抑菌圈为26.1 mm，比培养12 h增加了10.5 mm；培养箱中培养60 h后微胶囊的平均抑菌圈为28.7 mm，比培养12 h增加了13.1 mm。而对应的Brevilaterin标准样品抑菌圈并没有出现继续增大的现象，证明微胶囊具有缓释作用。

图6 Brevilaterin微胶囊缓释效应Fig.6 Slow-release effect of microencapsulated brevilaterin

图7 微胶囊对面包储藏期间霉菌数（A）和细菌总数（B）的影响Fig.7 Effect of microencapsulated brevilaterin on mold counts (A) and bacterial counts (B) during bread storage

由图7A可以看出，微胶囊添加量为3 000 AU/g与3 500 AU/g时可以有效抑制面包中霉菌的生长。面包中微胶囊添加量为3 000 AU/g与3 500 AU/g时均抑制了面包中霉菌出现的时间：空白对照组霉菌数第2天增长至103CFU/g，而此时添加微胶囊与丙酸钙的面包中霉菌数均低于10 CFU/g。微胶囊添加量为3 000 AU/g和丙酸钙添加量为1 g/kg的面包中第1天没有检测到霉菌，说明Brevilaterin与丙酸钙抑制了面包中霉菌的生长。微胶囊添加量为3 500 AU/g的面包中第3天才检测到霉菌，说明前两天微胶囊释放的Brevilaterin可以杀死面包中的霉菌，因此增大微胶囊的添加量可以进一步延长面包的货架期。

由图7B可以看出，面包中微胶囊添加量为3 000 AU/g与3 500 AU/g时，可以有效抑制面包中细菌的生长。空白对照组在第1天细菌总数就已经超过103CFU/g，第3天增长至107CFU/g，此后细菌总数稳定在106～107CFU/g范围内。面包中微胶囊的添加量为3 000 AU/g时在第2天和第3天分别检测到了少量细菌，此后由于微胶囊中的Brevilaterin释放杀死了面包中的细菌，所以第4～7天没有检测到细菌。面包中微胶囊添加量为3 500 AU/g时，在面包片储藏期间没有检测到细菌，说明增大微胶囊的添加量可以完全杀死面包中的细菌。添加1 g/kg丙酸钙的面包在第2天就检测到了细菌，第1～3天细菌总数快速增长到103CFU/g，第4～7天面包中的细菌持续增长至106CFU/g。该结果说明1 g/kg丙酸钙对面包中细菌生长的抑制效果低于3 000 AU/g微胶囊，并且增大微胶囊的添加量可以杀死细菌，进一步延长面包的货架期。

3 结 论

本研究优化了果胶包埋Brevilaterin的工艺，使得包埋率达到98.27%。通过扫描电子显微镜观察发现Brevilaterin微胶囊呈球形；激光粒度分析仪分析了微胶囊的粒径分布，平均粒径为1.8 μm；Zeta电位及红外光谱分析表明果胶通过静电相互作用与氢键作用力包埋Brevilaterin。琼脂扩散法及面包发酵证实Brevilaterin微胶囊具有缓释作用，且3 500 AU/g微胶囊的防腐效果优于1 g/kg丙酸钙，表明Brevilaterin微胶囊在面包防腐中具有较好的应用价值。