HPLC法同时测定采后莲雾果实7 种有机酸的含量

段云飞，吴光斌,*，叶 洪，陈昭华，张 珅，陈发河

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361000；2.宁德海关技术中心，福建 宁德 352100）

莲雾（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill &L.M.Perry）又名洋蒲桃、爪哇蒲桃、水蒲桃、甜雾等，为桃金娘科（Myartecae）蒲桃属水果[1]，原产于马来西亚、印度尼西亚和印度等国家，17世纪中国台湾最早引种[2]，是著名的热带亚热带水果。莲雾果实色泽艳丽，果形独特，清甜多汁，有特殊水果香味。莲雾果实中含有丰富的花青素、酚酸、有机酸和VC等多种有效成分[3-4]，有调节血脂、消炎、调节血糖、改善血液循环、减肥、清凉解渴等功效，具有较高的营养价值和经济价值[5-8]。

有机酸作为果实风味和营养物质的重要构成因素，影响水果的口感、色泽及生物稳定性，同时还是果品成熟度、耐藏性以及加工性的重要依据。有机酸是莲雾果实中的主要风味物质，其含量与莲雾的风味及品质密切相关，所以对莲雾中有机酸含量的检测具有重要意义[9]。有机酸含量的检测方法较多，主要有酶法[10-12]、气相色谱法[13-15]、毛细管电泳法[16-17]、离子色谱法[18-19]等。酶法每次只能测定一种有机酸；气相色谱法需要对不易挥发的有机酸进行衍生化反应，过程较繁琐；毛细管电泳法分离度较高，但稳定性较差，准确度不高，精密度不好。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法是当前普遍采用的分析有机酸的方法[20-23]，该方法具有分离效率高、准确度高和精密度好等优点，因此被越来越多的利用于快速检测领域。

本研究表明，采后莲雾果实絮状绵软和品质劣变进程与呼吸和能量代谢密切相关[24-25]，分析有机酸的变化是研究呼吸和能量代谢途径变化的重要手段。目前，关于莲雾果实中多种有机酸的HPLC法定量分析鲜见文献报道，本研究采用HPLC法对采后莲雾果实中有机酸的含量同时进行测定，并建立相应的测定方法，以期为采后贮藏过程中莲雾果实的品质变化和生理代谢提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以当日抵达福建厦门中国台湾水果集散中心的‘蜜风铃’莲雾（Syzygium samarangenese[Blume] Merrill &L.M.Perry）为材料。选择形状大小、成熟度基本一致、没有病虫害且无机械损伤的莲雾，于温度为（4f 0.5）℃、相对湿度为（85f 2）%的条件下贮藏。

丙酮酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸标准品（纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Sigma公司；磷酸二氢钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 HPLC仪（配有1314紫外检测器） 安捷伦科技有限公司；高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；RIOS 8超纯水系统 美国Millipore公司；AW 220托盘电子分析天平 日本岛津公司；PE 20 K型pH计 瑞士Mettler Toledo公司；KQ数控超声波清洗机 昆山市超声波仪器有限公司；LHS智能恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司；ULT1386超低温冰箱（-80 ℃）美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Atlanis T3色谱柱（4.6 mmh 250 mm，5 μm），流动相为pH 2.2的0.02 mol/L NaH2PO4缓冲溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脱：0～8 min，100%～75% A、0%～15% B；8～17 min，75%～70% A、15%～30% B；17～26 min，70%～100% A、30%～0% B；柱温25 ℃，流速0.5 mL/min，检测波长213 nm，进样量10 μL。

1.3.2 溶液的配制

缓冲溶液：配制0.02 mol/L的NaH2PO4溶液，用H3PO4调节pH 2.2作为流动相，超声后用0.45 μm的水相滤膜过滤。

单一标准储备液：精确称取适量丙酮酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和富马酸标准品分别置于50 mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液溶解稀释至刻度，得到质量浓度分别为0.750、3.000、0.010、0.050、0.300、1.500、0.096 mg/mL的标准品溶液，置于4 ℃条件下避光保存备用。

混合标准工作液：分别移取适量的各单一标准储备液，用磷酸盐缓冲溶液稀释至2、5、10、50、150、300 倍，得到梯度混合标准液。

1.3.3 样品溶液的提取

参照郭根和等[26]的方法，称取莲雾果肉15 g，用研钵研成匀浆，转移到50 mL容量瓶中，加入适量的流动相溶液，于75 ℃水浴加热浸提45 min，冷却至室温后定容。旋涡振荡2 min，超声提取30 min后过滤。取一定量的滤液，以4 000 r/min离心30 min，分离沉淀蛋白质、果胶等干扰物质，取上清液用0.45 µm孔径的滤膜过滤，滤液即为样液。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件对数据进行处理，Adobe Photoshop软件对图像进行处理。测定数据以表示。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

分别对7 种有机酸的标准溶液进行紫外扫描，结果表明7 种有机酸在213 nm附近均有较大吸收，故选择213 nm进行实验。

2.2 流动相梯度的选择

首先采用等度洗脱的方式，结果发现目标成分很难与干扰峰有效分离，出峰时间太晚且拖尾严重。而采用1.3.1节梯度洗脱的方式，则有较大改善，丙酮酸、苹果酸、乙酸和柠檬酸等峰能与干扰峰有效分离，峰形较好。在上述优化条件下，7 种有机酸标准品及莲雾样品的液相色谱图如图1所示，其相邻峰的峰形最佳，分离度较好，可以达到实验要求。

图1 7 种有机酸标准品（A）及莲雾样品（B）的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of seven organic acids in mixed standard solution (A) and those in wax apple sample (B)

2.3 流动相及其浓度的选择

有机酸在水相中大部分以离子态存在，而离子在反相色谱柱上几乎无保留，故采用抑制电离的方法，使其变为分子态酸在柱子上保留而得到分离。NaH2PO4缓冲溶液作为一种弱酸电离抑制剂在紫外区几乎无吸收，因此，用其作为测定有机酸的流动相，有利于有机酸的分离而不影响检测。

分别考察0.01、0.02、0.05 mol/L的NaH2PO4溶液对分离效果的影响。结果表明：当流动相浓度为0.01 mol/L时，丙酮酸和苹果酸、乙酸和柠檬酸分离度均小于1.5，不能很好地分离；当流动相浓度大于0.02 mol/L时，丙酮酸和苹果酸、乙酸和柠檬酸分离效果有较大改善，分离度大于1.5；0.05 mol/L的磷酸盐溶液对分离效果影响不大，并且较高浓度的盐溶液会对泵和柱子的寿命产生影响。综合考虑，选择0.02 mol/L的NaH2PO4溶液进行实验。

2.4 流动相pH值的选择

有机酸为弱酸，极性较大，流动相中水的比例很高，常发生酸电离。为了使有机酸尽可能以分子形式存在，一般使用酸性流动相抑制有机酸的解离，可通过调节流动相的pH值以达到抑制解离的作用。当pH值从2.2增加到2.4时，各有机酸的保留时间逐渐缩短；pH 2.4时，乙酸和柠檬酸重叠且有明显的前沿峰；pH 2.3时，乙酸和柠檬酸未实现完全分离；pH 2.2时7 种有机酸分离度均大于1.5。有机酸在水溶液中存在一个解离平衡，其大部分以解离形式或结合态形式存在，以分子形式存在的有机酸为少部分，所以较低pH值的流动相可以促进有机酸向分子形式转换，更利于液相色谱的测定。但若pH值太低，大部分有机酸保留时间延长，达不到快速分离效果，且低pH值的流动相对柱子寿命有影响，所以选择pH 2.2进行实验。

2.5 流速的选择

分别考察不同流速对7 种有机酸分离效果的影响。结果表明，流速较小时，7 种有机酸的保留时间延长，分析时间延长；流速较大时，7 种有机酸的保留时间缩短，分析时间也缩短。当流速为1.0 mL/min时，丙酮酸、苹果酸、乙酸和柠檬酸不能很好地分离；当流速为0.8 mL/min时，乙酸和柠檬酸不能很好分离；当流速为0.5 mL/min时，7 种有机酸可以得到较好分离，故选择流速0.5 mL/min进行实验。

2.6 柱温的选择

柱温升高可以降低流动相黏度、提高传质效率、缩短分析时间，但柱温太高不利于有机酸的分离且影响色谱柱的使用寿命。本实验中柱温对丙酮酸和草酸的分离效果影响较大，随着柱温升高，丙酮酸和草酸的分离度降低；当柱温为35 ℃时，丙酮酸和草酸重叠，不能分离；当柱温为30 ℃时，丙酮酸和草酸部分重叠，分离度较差；当柱温为25 ℃时，丙酮酸和草酸分离度大于1.5，因此实验中选用温度25 ℃进行实验。

2.7 标准曲线、线性范围和检出限测定结果

在优化的实验条件下，对不同质量浓度的7 种有机酸标准品进行测定。以各有机酸组分的峰面积为纵坐标（y）、对应质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，根据信噪比确定检出限（RSN=3）以及定量限（RSN=10）。如表1所示，7 种有机酸标准品呈现良好的线性关系，其相关系数范围为0.999 5～0.999 9，检出限为0.001～0.014 mg/g，定量限为0.003～0.042 mg/g。

表1 有机酸组分的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table 1 Calibration equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs and LOQs of seven organic acids

2.8 回收率和精密度测定结果

表2 有机酸组分的加标回收率（n=6）Table 2 Average recoveries of organic acids from spiked wax apple samples (n= 6)

向已知7 种有机酸含量的莲雾样品中分别加入高中低3 个水平的混合标准液，按照1.3.3节方法处理。每个加标水平平行测定6 次，计算相应组分的加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表2所示。7 种有机酸的平均加标回收率为86.84%～98.86%，RSD均小于5%，说明该方法精密度良好、准确度高。

2.9 样品测定结果

HPLC法测定莲雾果实中的有机酸含量时，由于各种有机酸的洗脱速度相近，会导致出峰时间间隔小。本研究采用超声辅助加热法，最大限度地提取了莲雾果实中的有机酸。通过对色谱条件的优化，实现了利用HPLC法对莲雾果实贮藏期间丙酮酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和富马酸7 种有机酸的同时定量测定。如表3所示，7 种有机酸含量的RSD均小于5%。

莲雾果实在1 2 d 贮藏期间丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸的含量整体呈下降趋势，含量变化范围分别为0.395～0.975、0.030～0.735、0.263～0.702、1.658～5.370 mg/g；苹果酸、抗坏血酸、富马酸的含量变化呈现为先上升后期下降的趋势，但最高值出现的时间略有不同。有研究结果表明，根据果实积累的主要有机酸可将植物果实分为三大类：苹果酸型、柠檬酸型和酒石酸型[27]。苹果[28]、梨[29]、香蕉[30]、李[31]中主要积累的有机酸为苹果酸，但同时也含有大量的琥珀酸和柠檬酸；杏[32]、芒果[33]等果实中主要积累的有机酸为柠檬酸，同时也含有大量的苹果酸；在葡萄及葡萄酒的研究中发现，酒石酸是葡萄酒中主要的酸味来源[34]，荔枝[35]中主要积累有机酸为酒石酸，同时也积累了大量苹果酸。本实验结果表明，莲雾果实中7 种有机酸含量大小依次为苹果酸＞柠檬酸＞丙酮酸＞乳酸＞乙酸＞富马酸＞抗坏血酸，莲雾果实主要积累的有机酸为苹果酸和柠檬酸，这一结果与李亚等[36]的检测结果一致。在贮藏期间，苹果酸的含量先上升后下降，柠檬酸含量一直下降，所以贮藏期间，莲雾果实中有机酸含量整体呈下降趋势。有机酸作为果实中主要的风味物质，其含量与果实的品质密切相关，因此在贮藏期间莲雾果实风味变淡，品质逐渐下降。

表3 莲雾果实贮藏期间7 种有机酸含量的变化（n=3）Table 3 Changes in the contents of seven organic acids during storage of wax apple (n= 3)

3 结 论

本研究采用Atlanis T3色谱柱为固定相，0.02 mol/L NaH2PO4（pH 2.2）和甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.5 mL/min，柱温25 ℃，紫外检测器波长213 nm。各有机酸组分的线性范围较宽，相关系数为0.999 5～0.999 9，检出限为0.001～0.014 mg/g，定量限为0.003～0.042 mg/g，RSD低于5%，加标回收率为86.84%～98.86%。该方法准确度高、回收率高，莲雾果实样品无需经过复杂的前处理，即可达到良好的分离效果。

植物果实中的有机酸是决定植物果实风味和品质的重要因素，本实验测定了采后莲雾贮藏期间7 种有机酸的含量变化。结果表明，莲雾果实贮藏12 d期间丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸的含量整体呈下降趋势，含量变化范围分别为0.395～0.975、0.030～0.735、0.263～0.702、1.658～5.370 mg/g；苹果酸、抗坏血酸、富马酸的含量变化呈先上升后期下降的趋势，但最高值出现的时间略有不同。本研究建立了HPLC法同时测定采后莲雾果实多种有机酸含量的方法，为进一步深入研究莲雾果实有机酸代谢与品质劣变的关系提供了技术手段，也为其他类水果多种有机酸研究提供参考。